脊髄性筋萎縮症における神経筋接合部におけるアグリンシグナル伝達とCav3.2との関連

May 01, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 18960 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

SMN タンパク質欠乏は、運動ニューロン疾患脊髄性筋萎縮症 (SMA) を引き起こします。 SMN ベースの治療は、患者の運動症状をさまざまな程度に改善します。 SMA の初期の特徴は、運動ニューロンと筋細胞の間のシナプスである神経筋接合部 (NMJ) の混乱です。 NMJ の形成は、アグリンとその共受容体であるリポタンパク質受容体関連タンパク質 4 (LRP4) および膜貫通筋特異的キナーゼ (MuSK) シグナル伝達経路によって引き起こされるアセチルコリン受容体 (AChR) のクラスター化に依存します。 我々は以前、フルナリジンがSMAモデルマウスのNMJを改善することを示したが、そのメカニズムは依然として解明されていない。 我々はここで、フルナリジンがC2C12筋管において細胞自律的、用量依存性およびアグリン依存性の様式でAChRクラスター化を促進することを示す。 これは、3 つのアグリン共受容体である LRP4、インテグリン-ベータ-1、およびアルファ-ジストグリカンのタンパク質レベルの増加に関連しています。 さらに、フルナリジンは、MuSK とインテグリン ベータ 1 およびホスホチロシンとの相互作用を強化します。 さらに、この薬剤は筋肉特異的に Agrn および Cacna1h 遺伝子の発現とスプライシングに作用します。 我々は、Cacna1hがコードするタンパク質Cav3.2が、インビトロでアグリン共受容体LRP4と密接に関連していることを明らかにした。 in vivoでは、新生児の発育中にNMJの近くで濃縮され、この薬物はSMA筋肉におけるこの免疫標識を増加させます。 したがって、フルナリジンは NMJ の主要な役割を調節し、NMJ の生物学に関与する新しいタンパク質として Cav3.2 を特定します。

脊髄性筋萎縮症（SMA）は、脊髄運動ニューロンの変性と筋萎縮を特徴とします。 SMA は、生存運動ニューロン 1 (SMN1) 遺伝子の変異によって引き起こされ、SMN タンパク質レベルの低下を引き起こします 1,2。 このタンパク質は、転写、スプライシング、RNA 輸送、翻訳などの遺伝子発現の制御に関与する遍在的に発現する DNA/RNA 結合タンパク質であり、最も特徴的な機能は、U に富んだ低分子核リボ核タンパク質 (snRNP) 生合成におけるその役割です3。 4,5。 ヒトでは、SMN2 コピー遺伝子が存在すると、最後のコーディングエクソン 76 の選択的スプライシングにより、完全に機能しないタンパク質が提供されます。したがって、SMN2 遺伝子のコピー数が増加すると、より穏やかな SMA 表現型が観察されます 7,8。 承認された SMA 治療は、SMN 遺伝子治療を使用するか、アンチセンス オリゴヌクレオチド (ASO) または小分子で SMN2 プレ mRNA を標的にすることによって、SMN タンパク質レベルを増加させることに特化しています。 これらの驚異的な科学的および臨床的進歩にもかかわらず、一部の患者はそれらの薬を服用できず、他の患者は反応が悪く、場合によっては副作用が見られます9、10、11、12、13。 したがって、疾患の根底にあるメカニズムをより深く理解することは、臨床的に重要なより良い治療法の出現に貢献するはずです。

神経筋接合部 (NMJ) の欠陥は、「ダイイングバック」表現型と一致する運動ニューロン喪失前の SMA の病因で観察されています 14、15、16。 実際、SMA モデルマウスでは、成熟の遅延、終板面積の縮小、および終板の脱神経が検出されています 17、18、19。 NMJ の特徴は、運動ニューロンから分泌されるアグリンによって媒介されるシナプス後筋膜上の筋アセチルコリン受容体 (AChR) のクラスター化です。 アグリンは受容体 LRP4 に結合し、その後、アグリン-LRP4 複合体が膜貫通型 MuSK に結合して活性化し、ドッキングタンパク質 7 (Dok7) などのアダプターを介して AChR クラスター化を促進します 21,22。 さらに、機能的なAgrn、Lrp4、またはMusk遺伝子を欠損したマウスは周産期に死亡します。

Agrn 遺伝子は、2 つのプロモーターと、Y 部位や Z 部位などの C 末端のドメインをコードするエクソンの選択的スプライシングを使用して、さまざまな組織で複数のアイソフォームを生成します 23、24、25。 代替の第 1 エクソンは分泌型 (NtA) または膜貫通型 (Tm) N 末端のいずれかをコードしており、後者は主にニューロンで発現されるのに対し、NtA は筋肉などの非神経細胞でも発現します 26。 神経 Z+ アグリン アイソフォームは、筋肉 Z- アグリンと比較して AChR を大きくクラスター化します 23。 細胞外マトリックス (ECM) の構成要素として、アグリンはラミニン、ヘパリン、α-ジストログリカン、β1 インテグリンにも結合します 27,28。 したがって、アグリンはさまざまな機能にも関与しています。NMJ の維持 29、心臓再生の促進 30、神経突起伸長の阻害 31、32、33、中枢神経系におけるシナプス形成の制御 34、および神経系における LRP4/MuSK 経路とインテグリン β1 経路間のクロストークを調整します。肝臓がん35,36。

SMA 疾患におけるアグリン/LRP4/MuSK/Dok7 シグナル伝達経路の役割は、アグリン Z+ エクソンが SMA モデルマウスの脊髄運動ニューロンでミススプライシングされているという観察によって初めて強調されました 37 が、これは AAV-9 の共発現によって修正することができます。 U7 特異的 Lsm10 および Lsm11 タンパク質 38. トランスジェニック Z+ アグリンの過剰発現、治療用アグリンの注射、または AAV-Dok7 送達のいずれかによるアグリン シグナル伝達の調節により、SMA マウスの表現型が緩和されます 39、40、41。 また、MuSK アゴニスト抗体は、SMA マウスの神経筋欠陥を軽減します 42。 したがって、アグリンシグナル伝達を介したNMJ機能の改善は、SMAモデルマウスの病因に対する治療効果をもたらします。 しかし、SMA マウスおよび治療後の Z+ エクソン以外の Agrn エクソンの発現は、依然としてほとんど解明されていません。

SMA 疾患における NMJ の関与は、フルナリジンが SMA マウスの終板面積と NMJ の成熟を増加させ、疾患表現型を改善することを報告したときにさらに説明されましたが、それは snRNA および Agrn Z+ エクソンのレベルとは無関係でした 43。 NMJ に対する正確な作用機序は不明のままです。 フルナリジンは以前に T 型カルシウムチャネル遮断薬として使用され 44、化学スクリーニングでスプライシング制御因子として同定されました 45。 SMA モデルでは、カルシウム レベルと RNA 代謝の両方が変化します 46、47、48、49、50、51。 さらに、SMA マウスの ASO 治療は、T 型カルシウム チャネル Cav3.247 をコードする Cacna1h を含むいくつかの遺伝子の U12 依存性イントロンのスプライシング欠陥を軽減します。

次に、骨格筋における Agrn および Cacna1h 遺伝子の発現とスプライシングに対するフルナリジンの作用を想定しました。 この疑問に対処するために、我々は、フルナリジンが対照マウスおよびSMAモデルマウスにおいてNMJサイズをどのように増加させるかを研究しました。 薬物の効果は筋肉依存性およびSMN非依存性であるため 43、培養マウス C2C12 筋管に対するフルナリジンの効果を評価しました。 我々は、この薬剤が in vitro で NMJ 形成の初期イベントである AChR クラスター化を刺激することを報告します。 この効果は、Cav3.2 電流の阻害と同様の濃度依存性を持ち、チャネル遮断が必要であることを示唆しています。 さらに、我々は、Agrn 遺伝子と Cacna1h 遺伝子の発現とスプライシングがフルナリジンによって同時調節されているようであることを in vitro および in vivo で明らかにしました。 また、アグリン共受容体 LRP4 が Cav3.2 と関連していることも示し、マウスの新生児期には近くに局在する NMJ が見出されます。 重要なことは、SMA 筋肉における Cav3.2 免疫標識がフルナリジンによって増加することです。 したがって、我々は、フルナリジンの効果がCav3.2と周産期NMJの形成および成熟に関連していると提案します。

我々は以前に、フルナリジンが対照マウスおよびSMAモデルマウスのSMNタンパク質レベルとは無関係にシナプス後NMJを拡大させることを示しました43。 これは、筋肉がフルナリジンに直接反応する可能性があることを意味します。 この考えを検証するために、フルナリジンが、筋管を形成するために融合した培養C2C12マウス筋芽細胞におけるAChRクラスターの形成をin vitroで刺激するかどうかを評価しました（図1A）。 AChR クラスターは、蛍光α-ブンガロトキシン (α-BTX) を使用して視覚化されます。 フルナリジン (4 μM) は、クラスターの数とサイズを 3 ～ 4 倍に大幅に増加させました (図 1B、E)。 さらに、フルナリジン誘発クラスター化は用量依存性でした (図 1C)。 最大半分の濃度 (EC50) は 1.3 μM で、4 μM でクラスタリングに最大の効果が得られました。 また、安定して発現している HEK293 細胞における T 型カルシウムチャネル Cav3.2 上のフルナリジンを評価しました (図 1D)。 電気生理学的記録により、Cav3.2 チャネル活性に対する同様の薬物濃度依存性がフルナリジンにも見られることが明らかになりました (IC50 = 3.44 μM)。 注目すべきことに、フルナリジン阻害の時間経過は、10 μM フルナリジンによる最大阻害が 5 分間のインキュベーション期間後に到達することを示しています (補足図 7)。 したがって、フルナリジンは、おそらく Cav3.2 チャネルに対する直接作用を通じて AChR クラスター化を刺激し、SMA モデルマウスにおける薬物の有益な効果における筋細胞の直接的な役割を示唆しています。

フルナリジンは、マウス C2C12 筋管における AChR クラスター化を促進します。 (A) C2C12 筋細胞の培養と治療の概略図。 (B) DMSO およびフルナリジン (FZ) で処理した筋管上のα-ブンガロトキシン (α-BTX) による AChR クラスターの蛍光イメージング。 (C) AChR クラスター化のフルナリジン用量反応曲線 (100、250、500、1000、4000 および 10,000 nM の各濃度で 3 ≤ n ≤ 5、10 μM の 2 を除く)。 (D) Cav3.2 チャネルに対するフルナリジンの効果の濃度応答曲線。 各点について、平均電流密度をビヒクル群の平均電流密度に正規化した(各濃度について7 < n < 24、エラーバーはSEM)。 (E) AChR クラスターのサイズと数の両方が薬剤とともに増加しました。 列は、3 つの独立した実験 (条件あたり 345 個の筋管) から ImageJ を使用して分析された条件あたりの同じ数の筋管のクラスターの数を表します。 (F) 7 日間の増殖培地 (PM) 中の C2C12 筋芽細胞および分化培地中の DMSO および FZ 処理筋管の総タンパク質抽出物における内因性タンパク質の発現 (Diff7)。 一晩のDMSOおよびFZ処理後に細胞を回収した。 PVDF 膜を、ストリッピングステップの有無にかかわらず、指定の抗体で免疫ブロットしました。 α-チューブリンはローディングコントロールとして機能します。 薬剤によるチューブリン負荷対照と比較して、GAPDH タンパク質レベルの 50% 増加が検出されます。 トリミングされていない画像を補足の図3に示します。(G)列は、DMSO処理(1μl/ml)と比較したFZ処理筋管におけるタンパク質発現の変化倍数を表します。 (H) 陰性対照 IgG と比較した、フルナリジン (FZ) 存在下での AChR クラスター化に対するアグリン (抗アグリン)、インテグリン β1 (抗 ITGB1) およびα-ジストグリカン (α-Dg1) に対するブロック抗体の効果。 (I) 列は、実験ごとの各条件のランダムに選択された 40 個のフィールドからのクラスター (サイズ > 5 μm) の数を表します。 エラーバーは、3 つの独立した実験の平均値からの SD を表します。 フルナリジンは水溶液に不溶であるため、対照条件では希釈DMSOを使用します。 Khi-2 テスト、*、P < 0.05; **、P < 0.01; ***、P < 0.001。 スケールバー、30μm。

AChR クラスター化を誘導するフルナリジンのメカニズムを詳しく調べるために、AChRα サブユニット、Lrp4、MuSK、ジストログリカン (dg)、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II (CaMKII)、C2C12 のインテグリン β1 および α11 に焦点を当てて、主要な NMJ 分子のタンパク質レベルを調べました。筋管 (図 1F、G)。 AChRα、MuSK、β-ジストグリカンのタンパク質レベルではフルナリジン（4μM）の影響は検出されなかったが、Lrp4、β1、α11インテグリンとα-ジストログリカンエピトープではそれぞれ30、50、60、70％の増加が観察された。 また、ダイナミン 2 (Dyn2) の過剰発現が AChR クラスター化を誘導し 52、NMJ の発達を調節するかどうかも検討しました 53。 フルナリジンでは、Dyn2 および GAPDH タンパク質レベルの増加が示されました。 CaMKII タンパク質レベルまたはリン酸化に対する薬物効果は観察されず、AChR の発現とクラスター化も調節する CaMKII の関与の可能性は除外されました 54,55。 SMN および Unrip (別の SMN 複合体構成要素) タンパク質レベルは、予想どおり変化しませんでした 56。 したがって、Lrp4/MuSK、β1インテグリンおよびα-ジストグリカンはすべてNMJ生物学に関与するアグリン受容体であるため、フルナリジンはアグリンシグナル伝達を促進する可能性があります25。

私たちの実験におけるアグリンの唯一の供給源は C2C12 筋管に由来します。 次に、アグリン、インテグリン-β1、またはα-ジストグリカンをブロックする抗体が、フルナリジン誘発性AChRクラスター化に影響を与えるかどうかを尋ねました。 筋管を薬物と抗アグリンマウスモノクローナル抗体Mab520435または抗インテグリンβ1マウスモノクローナル抗体Mab196557または抗α-ジストグリカンマウスモノクローナル抗体IIH6C458またはネガティブコントロールマウス抗体で処理しました（図1H、I）。 。 我々の条件下では、Mab5204 および Mab1965 抗体は AChR クラスター化を顕著に阻害しましたが、IIH6C4 およびコントロール抗体は阻害しませんでした。 さらに、α-ジストログリカンはフルナリジン処理筋管のすべてのAChRクラスターに局在しており（補足図4）、形成ではなくクラスターの安定化における役割をさらに裏付けています59。 したがって、フルナリジン誘導性 AChR クラスター化は、インビトロでのアグリンおよびインテグリン β1 に依存します。

これまでに提示された結果は、フルナリジンがC2C12由来アグリンのAChRクラスター化活性を増強することを示した。 次に、この薬剤が筋肉の Agrn 遺伝子発現とそのスプライシングされたアイソフォームに影響を与えるかどうかを評価しました。 アグリンは、2 つの異なる転写開始部位から発現され、2 つの N 末端、分泌型 NtA または膜貫通 TM が生じ、その後に共通配列と、インテグリン β1 の結合部位を含む C 末端領域をコードする代替 Y および Z エクソンが続きます。およびLRP4、それぞれ28（図2A）。 Z 部位が AChR クラスタリングを大幅に強化することがわかっているため 60、フルナリジンが Z エクソンの包含を促進できる可能性があります。 実際、我々は、C2C12筋管にはそれらが存在せず、薬物によって誘導されないことを示し、この可能性を除外します（図2B）。 したがって、我々は、フルナリジン誘導性 AChR クラスター化が Z+ アグリンから独立していることを発見しました。

SMAモデルマウスのC2C12筋管および骨格筋におけるAgrn遺伝子の発現およびスプライシングプロファイルに対するフルナリジンの影響。 (A) 可溶性基底層関連アグリン (NtA) または膜貫通ドメインの代替の最初のエクソン使用と、N 末端およびスプライス部位の短い細胞内領域 (TM) を示すアグリン構造の概略図C 末端の「Y」および「Z」と、Agrn 遺伝子の Y および Z エクソンの概略図。 (B) DMSO およびフルナリジン (FZ) で処理した C2C12 筋管における Agrn Z エクソンのアガロースゲルでの RT-PCR による代表的な分析 (Diff7)。 （C – E）Agrn遺伝子のNtA、Tm、ex5-6、ex29-30およびYエクソンの発現のRT-qPCR分析は、増殖培地（PM）中の筋芽細胞と比較してC2C12筋管で実行されます。 全 RNA は、増殖培地 (PM) で増殖させた C2C12 筋芽細胞から、または DMSO またはフルナリジン (FZ) を加えた分化培地 (D7) で 7 日間培養した後に最後の 16 時間培養した C2C12 筋芽細胞から調製します。 (C) の RNA レベル、(D) のエクソンと ex5-6 RNA レベル間の発現比、(E) の NtA 対 TM の比率が計算されます。 Ex5-6 はすべての Agrn mRNA に含まれます。 C および D では、PM に任意の値 1 が与えられました。(F–N) Agrn 遺伝子のさまざまなエクソン発現の RT-qPCR 分析は、ヒラメ筋 (F)、足底筋 (G)、および脛骨筋 (H) で実行されます。 P10のコントロールマウスとSMAモデルマウスの結果。 対照ビヒクルには、任意の値 1 が与えられます。第 1 エクソン NtA 対 Tm の比率は、ヒラメ筋 (I)、足底筋 (J)、および脛骨筋 (K) について計算されます。 エクソンと ex5-6 レベル間の発現比は、ヒラメ筋 (L)、足底筋 (M)、および脛骨筋 (N) について計算されます。 3 つの遺伝子は、C2C12 (Ppia、Gapdh、5S または Dusp6、Rragc、5S) および骨格筋 (Rpl13a、Ppia、Myh4) の正規化のコントロールとして使用されます。 エラーバーは、C2C12細胞および1群あたり3匹のマウスを用いた3回の独立した実験からの3回の平均値からのSDを表す。 NS は有意ではない (P > 0.05)、*P < 0.05、** < 0.01、*** P < 0.001。 学生の t 検定。

他の Agrn アイソフォームがフルナリジンで生成されるかどうかを明らかにするために、Agrn エクソン、つまり NtA、Tm、ex5-6 (すべてのアイソフォームに含まれる)、ex29-30 (すべてのアイソフォームの 3' 領域) およびY インサートが含まれます (補足表 2)。 C2C12の分化は、総Agrn mRNAレベルの減少（ex5〜6）およびYインサートの包含の増加と関連していた（図2C）。 NtA レベルは分化しても変化しませんでしたが、Tm レベルは著しく減少しました。 フルナリジンは、C2C12筋管におけるNtAエクソンレベルを約25%減少させ、エクソン/ex5-6比は変化しなかった(図2D)。 さらに、NtA 対 Tm の比率は、(予想通り) Tm アイソフォームよりも NtA の方が多く、分化により Tm アイソフォームよりも NtA の増加が観察されること、およびフルナリジンによる減少が観察されることを示しました (図 2E)。 したがって、我々は、フルナリジン誘導性 AChR クラスター化が C2C12 筋管における Y+Z- Agrn アイソフォームと相関していることを発見しました。

骨格筋における Agrn 発現を調査するために、生後 1 日目のビヒクル (V) およびフルナリジン (FZ) 処理対照 (ヘテロ接合体) および SMA モデル マウスの 3 つの後肢筋肉、すなわちヒラメ筋、足底筋および脛骨筋における Agrn エクソン レベルを調査しました。 10（P10）。 これらの筋肉は、胎児および新生児のミオシン アイソフォームの割合、および I 型および II 型線維の組成によって示されるように、成熟の点で異なります 43。 SMA モデルマウスでは 2 つの伸筋 (ヒラメ筋と足底筋) の成熟が変化しますが、新生児ミオシン重鎖の発現によって示されるように、脛骨屈筋はあまり影響を受けません 17,43。 私たちは、約 12 日での変異体の死による生前の変化ではなく、特定の影響を反映する時点を選択しました 43。 SMA 脛骨筋とヒラメ筋ではそれぞれ Agrn ex5-6 レベルの 60 ～ 80% の顕著な減少が観察されましたが、対照と比較して SMA の足底筋では約 15% の緩やかな減少が見られました (図 2F-H)。 SMA ヒラメ筋では NtA と Tm エクソンの両方が減少しましたが、SMA の足底筋と脛骨筋では NtA のみが減少しました。これは、フルナリジンで脛骨筋のみを回復した SMA 筋肉の分泌アイソフォームの欠損を示しています。 さらに、フルナリジンは、対照およびSMA脛骨のAgrnエクソンレベルを同様に増加させました。 NtA エクソンは、対照および SMA ヒラメ筋および脛骨筋では Tm よりも優先的に発現されましたが、SMA 足底筋でも同様に見られました（図 2I-K）。 フルナリジン処理した SMA ヒラメ筋および足底筋では ex5-6 レベルが低下しましたが、Tm/ex5-6 比は増加しました。これは、2 つの転写開始部位が薬物に対して同様に感受性ではないことを示しています (図 2L-N)。 また、Y エクソン/ex5-6 比は、フルナリジンでは SMA の足底筋および脛骨筋ではコントロールと同様の値を示しましたが、ヒラメ筋ではそうではありませんでした。 したがって、Agrnアイソフォームの発現は、フルナリジンが調節する筋肉特異的な様式でSMAマウスにおいて変化する。

Agrn アイソフォームの発現レベル (図 2) と NMJ サイズ 43 に対するフルナリジンの作用の間に完全な相関関係がないことは、追加のイベントが薬物効果に寄与していることを示唆しています。 フルナリジンは、それぞれ Cacna1g、Cacna1h、および Cacna1i 遺伝子によってコードされる T 型カルシウム チャネル Cav3.1、Cav3.2、および Cav3.3 のブロッカーとして分類されているため 44、次に、この薬物が Cacna1h 発現を調節できるかどうかを調査しました。 注目すべきことに、Cacna1g および Cacna1i 転写物は我々の発見限界を下回っていたため、検出できませんでした。 したがって、Cacna1h 遺伝子の発現とスプライシングの分析用にプライマーを設計し、検証しました: ex2-3 (U12 依存性イントロンに隣接するエクソン)、ex15-16 (すべての Cacna1h mRNA に含まれる)、ex25 (選択的スプライスされたエクソン 25)、 ex32-33 (すべての Cacna1h mRNA の 3' 領域) プライマー (補足表 2、図 3A)。 Ex15-16レベルはC2C12筋芽細胞と筋管の間で同様であったが、ex2-3およびex25レベルは分化とともに増加した(図3B)。 フルナリジンは、ex15-16 および ex25 レベルをそれぞれ 50% および 40% 減少させましたが、筋管内の ex2-3 レベルには影響を与えませんでした。 さらにエクソン/ex15-16 比を評価しました (図 3C)。 この薬剤では、ex32-33/ex15-16 比の期待値 1 が得られましたが、ex2-3/ex15-16 比では約 3 倍の増加が見られ、Cacna1h 転写物における U12 イントロンのスプライシングが相対的に増加していることを示しています。 さらに、フルナリジン処理した C2C12 筋管における Cav3.2 タンパク質レベルの 25% 減少を示しました (図 3D)。 我々の結果は、ここで使用した抗体の特異性も裏付けました。 U12 イントロンは U2 イントロンよりもゆっくりと除去されるため、成熟転写物の発現レベルを決定します 61。 したがって、フルナリジンは in vitro Cacna1h mRNA レベルを低下させますが、これは U12 イントロンの除去によって部分的に補われます。 マイナー snRNA 遺伝子送達は SMA マウスの疾患表現型を改善します62。 snRNAレベルは薬物によって変化しませんでしたが（補足図1）、我々のデータは、C2C12筋管における薬物の潜在的な標的としてマイナーなU12スプライセオソームを関連付けています。

SMAモデルマウスのC2C12筋管および骨格筋におけるCacna1h遺伝子の発現およびスプライシングプロファイルに対するフルナリジンの影響。 (A) Cacna1h 遺伝子のエクソン 2 および 3 (ex2-3) と選択的スプライシングされたエクソン 25 が隣接する U12 イントロンの概略図が示されています。 (B) Cacan1h 遺伝子の ex2-3、ex15-16、ex25、および ex29-30 エクソンの RNA レベルの RT-qPCR 分析を、増殖培地 (PM) 中の筋芽細胞と比較して C2C12 筋管で実行します。 (C) エクソンと ex15-16 RNA レベル間の発現比。ex15-16 はすべての Cacna1h mRNA に存在します。 Total RNA は、増殖培地 (PM) で増殖させた C2C12 筋芽細胞から、または DMSO またはフルナリジン (FZ) を含む分化培地 (Diff7) で 7 日間培養した後に最後の 16 時間培養したものから調製します。 (D) Cacna1h がコードするタンパク質 Cav3.2 のイムノブロット分析により、フルナリジンによる C2C12 筋管の総タンパク質抽出物のタンパク質レベルの有意な 20% 減少が確認されました (n = 3)。 トリミングされていない画像を補足の図3に示します。（E〜G）Cacan1hエクソンのRNAレベルは、それぞれヒラメ筋、足底筋、脛骨筋のP10で測定されます。 (H–J)エクソンとex5-6 RNAレベル間の発現比は、ヒラメ筋、足底筋、脛骨筋についてそれぞれ計算されます。 エラーバーは、C2C12細胞および1群あたり3匹のマウスを用いた3回の独立した実験からの3回の平均値からのSDを表す。 NS、有意ではない (P > 0.05)、*P < 0.05、** < 0.01、***P < 0.001。 学生の t 検定。

次に、対照マウスと SMA マウスの骨格筋における Cacna1h 遺伝子発現を測定しました (図 3E-J)。 我々は、SMA 変異体における ex15-16 レベルと、対照および変異体に対するフルナリジンの効果が筋肉特異的であることを示しました。 実際、対照と比較した場合、SMAヒラメ筋ではex15-16レベルの3倍の減少が観察され、一方、SMA足底筋では約5倍の増加が見られました（図3E-G）。 フルナリジンは、SMA 足底筋の ex15-16 レベルの上昇を低下させましたが、SMA ヒラメ筋のレベルを回復しませんでした。 同様に、Agrn遺伝子で観察されたもの(図2H)と同様に、SMA脛骨筋は対照と同程度のCacna1h mRNAレベルを発現し、薬物により同様に増加した(図3G)。 代替 ex25 レベルは、対照と比較して SMA の足底筋および脛骨筋で増加しましたが、SMA ヒラメ筋では減少しました。 フルナリジンは、SMA 脛骨筋の mRNA における相対的な ex25 の組み込みを修正しましたが、対照の足底筋ではそれを増加させました。 ex2-3/ex15-16 の比は、フルナリジン処理した SMA ヒラメ筋および足底筋では低いままであり、U12 イントロンの保持が持続していることを示しています。 重要なことに、フルナリジンで処理した足底SMAではex32-33/ex15-16比が1の値を示し、この薬物による完全長mRNAの増加が示唆されました。

CaV3.2 電流はマウス新生児筋線維で検出されています 63。 次に、筋線維における Cav3.2 の分布がフルナリジンの影響を受けるかどうかを尋ねました。 この目的を達成するために、P5およびP10の対照および足底SMAの連続切片に対して、抗I型MyHC7（遅いI型線維）および抗Cav3.2抗体を使用した共標識免疫蛍光実験を実施しました（図4A、補足図。 8)。 SMA マウスは P543 で症状を発現し始めます。 抗 Cav3.2 抗体は、筋線維の細胞質および膜標識を明らかにしました。 Ｐ５とＰ１０の間のＩ型筋線維における総蛍光の減少が、ビヒクル処理対照を除くすべての条件で観察された（図４Ｂ）。 フルナリジン処理した SMA I 型ファイバーは、ビヒクル処理した SMA ファイバーと比較して、P10 で細胞質蛍光を回復しました。 フルナリジンは、対照におけるMyHC7陰性線維(おそらくラピッドII型)の総Cav3.2蛍光強度に影響を及ぼさなかったが、それらのSMA線維では増加が観察された。 したがって、線維の種類ごとにフルナリジンに対する反応が異なります。

フルナリジンは、SMA マウスの新生児発育中の筋線維 Cav3.2 免疫標識の減少を防ぎます。 (A) Cav3.2 (緑) および MyHC7 (赤) による筋線維免疫染色は、それぞれ P5 および P10 のビヒクル (V) およびフルナリジン (FZ) で処理した対照および SMA マウスの足底筋について示されています。 元の画像は補足の図8に示されています。(B)パネルAで検出されたCav3.2の個々の筋線維の正規化された蛍光強度が示されています。 各記号はファイバー内の蛍光強度の合計値を表します。 蛍光の平均値を補足の図9に示します。MyHC7免疫標識または非標識線維の4グループのマウスの分布を、スチューデントのt検定を使用して比較します。 NS は有意ではない (P > 0.05)、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001 (1 グループあたり 3 匹のマウス)。 スケールバー、50μm。

以前の研究では、運動ニューロン 64,65、血管 66、筋肉感覚求心性神経では Cav3.2 発現が見られるが、シュワン細胞では見られず 67、これらすべての細胞型が筋肉組織に存在することが示されています。 ここでは、筋線維とNMJのCav3.2膜標識に焦点を当て、AChRを標識するために蛍光α-BTXで対比染色したP10のCav3.2標識筋肉切片を観察しました（図5A〜D）。 我々の免疫蛍光実験では、P5 および P10 筋肉切片において Cav3.2 の免疫反応性が蛍光 α-BTX による標識の免疫反応性に近いことが示され、Cav3.2 が NMJ の近くに存在することが示されました。 また、フルナリジンが SMA 筋肉の NMJ 付近の Cav3.2 免疫染色を増強することも示しました (図 5D)。 したがって、筋線維における Cav3.2 分布の欠陥が SMA の発症に寄与している可能性があります。

Cav3.2 タンパク質は神経筋接合部付近に豊富に存在しており、SMA マウスの筋肉ではフルナリジンによってその欠損が改善されます。 (A) シナプス後 NMJ での Cav3.2 免疫標識の概略図。 MN 運動ニューロン、SC シュワン細胞、SM 骨格筋。 (B) Cav3.2 の蛍光実験により、ビヒクル処理対照マウスの足底 P5 のクライオスタット切片における AChR およびその運動ニューロン内の α-BTX 染色を使用して、NMJ のシナプス後部位近くの標識が明らかになりました。 画像はα-BTX染色をフォーカスしたものです。 (C) 蛍光実験により、対照マウスの足底 P10 のクリオスタット切片における AChR の α-BTX 染色で証明されるように、NMJ のシナプス後部位付近の Cav3.2 の蓄積が明らかになります (上のパネル)、減少 (中央のパネル)、および回復SMA マウスにフルナリジンを投与した場合 (下のパネル)。 スケールバー、10μm。 (D) パネル B で検出された Cav3.2 の個々の NMJ の正規化された平均蛍光強度が示されています。 各記号は個々の NMJ の蛍光強度の平均値を表します。 P5 でのビヒクル処理対照ファイバーの蛍光には、任意の値 1 が与えられます。Cav3.2 免疫標識 NMJ の 4 グループのマウスの分布は、GraphPad を使用した Mann-Whitney 検定を使用して比較されます。 NS、有意ではない(P > 0.05)、* P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001 (1グループあたり3匹のマウス、合計600のNMJ)。

フルナリジンがCav3.2とアグリン-LRP4-MuSK経路間のタンパク質相互作用を調節するかどうかを調べるために、C2C12筋管を薬物で処理し、固定し、異なる方法で生成した抗体を用いた細胞内免疫共沈降タンパク質ライゲーションアッセイ（PLA）を使用して評価しました。種と各タンパク質に特異的なものです (図 6)。 AChR クラスタリングに重要なタンパク質に焦点を当て、LRP4-MuSK、LRP4-Cav3.2、MuSK-インテグリン β1、MuSK-ホスホチロシン、インテグリン α11-β1、および Dyn2-インテグリン β1 のペアをテストしました。 近接した (< 40 nm) 2 つのタンパク質間の PLA 陽性シグナルは、DMSO 処理とフルナリジン処理した C2C12 筋管間で比較できる蛍光ドットとして現れました。 特定の PLA シグナルがすべての組み合わせで検出されました。 LRP4-Cav3.2 および LRP4-MuSK の組み合わせによる陽性シグナルは、C2C12 筋管における構成的なタンパク質結合を示していました。 また、フルナリジンがインテグリン-β1とMuSKおよびインテグリン-α11の両方との結合を強化するのに対し、Dyn2-インテグリン-β1の結合は減少することも見出した（図6B）。 MuSK リン酸化は可溶性免疫沈降タンパク質画分では検出されませんでしたが (補足図 10)、MuSK およびホスホチロシンで生成された PLA シグナルはフルナリジンによって顕著に増加しました。 したがって、フルナリジンは主要な NMJ タンパク質の密接な会合を変化させます。

フルナリジン処理した C2C12 筋管における主要な NMJ タンパク質相互作用の視覚化。 (A) 以下のタンパク質ペアに対する特異的抗体を用いた C2C12 筋管における内因性タンパク質相互作用の in situ PLA 検出: LRP4-MuSK、LRP4-Cav3.2、MuSK-インテグリン β1、インテグリン α11-β1、Dyn2-インテグリン β1、および MuSK-ホスホチロシン。 ネガティブコントロールとして、1 つの一次抗体が省略されるか、ネガティブコントロール抗体 (DAKO) に置き換えられます。 PLA 陽性シグナルは明るい点として示されています。 (B) パネル A で検出された個々の C2C12 筋管の平均蛍光強度の変化倍数を示します。 ImageJ で分析した筋管の数を補足の表 3 に示します。スケール バー、30 μm。

酸化損傷も、運動ニューロン疾患における NMJ の変化に寄与する可能性があります 68。 フルナリジンは、他のカルシウムチャネル遮断薬が膵臓ベータ細​​胞で行うのと同様に、SMA 患者の線維芽細胞のプロオキシダント TXNIP を減少させます 56。 興味深いことに、Txnip 転写物は、SC が豊富な筋肉 70 と比較して、衛星細胞 (SC) のない筋肉で上方制御されており、これは SMA マウスの筋肉における SC 数の減少を彷彿とさせます 71、72、73。 フルナリジンで処理したSMAマウスの筋肉におけるTxnip発現を調べました（図7）。 フルナリジンは、SMA筋肉における上方制御されたTxnip mRNAレベルを減少させた(図7A)。 TXNIPおよびMyHC7（I型線維）に対する抗体を用いた免疫蛍光同時標識実験により、すべての新生児筋線維がTXNIP陽性であり、対照では2％が強く標識されていたが、SMAヒラメ筋では16％が標識され、フルナリジンでは10％に減少したことが明らかになった（図1）。 .7B、C）。 これは、廃用された成体マウスおよびラットの筋肉における高いTXNIP発現と一致します74。 したがって、フルナリジンは、SMA マウスの筋肉内の上昇した Txnip mRNA レベルを低下させます。

フルナリジンは、SMA モデル マウスの骨格筋における Txnip 発現レベルの増加を減少させます。 (A) ビヒクル (V) およびフルナリジン (FZ) で処理した対照 (Ctrl) および SMA モデル マウスのヒラメ筋、足底筋および脛骨筋における Txnip RNA レベル。 ビヒクル処理対照（Ctrl V）には任意の値 1 が与えられます。 NS は有意ではありません（P > 0.05）、*P < 0.05、** < 0.01、***P < 0.001、スチューデントの t 検定（1 グループあたり 3 匹のマウス） ）。 (B) 抗TXNIP (緑) および抗MyHC7 (赤) 抗体による筋線維免疫染色を、ビヒクルおよびフルナリジンで処理した対照マウスおよびP11 の SMA マウスのヒラメ筋について示します。 (C) 列は、TXNIP 陽性が強い線維の割合を表します (1 グループあたり 3 匹のマウス)。 エラーバーは平均値からのSDを表します。 スケールバー、30μm。

SMA 患者には、生存率と運動機能を改善する 3 つの SMN 回復療法が存在しますが、治療に対する患者の反応はさまざまです。 したがって、既存の SMA 治療を最適化するか、新しい治療を導入するには、追加の治療標的を特定する必要があります。 我々は以前に、フルナリジンが SMA モデルマウスの筋線維サイズ、NMJ 領域、および神経支配を増加させることを示しました 43。 本明細書では、NMJに対するフルナリジンを評価するために骨格筋に焦点を当てた。 われわれは、フルナリジンがNMJの形成と成熟に関与するアグリンシグナル伝達経路を調節できることを示し、SMAの病因に対するさらなる洞察を提供する。

運動ニューロン疾患のマウスモデルと患者は、NMJ 欠損を示します 75,76。 シナプス機能不全は、感覚運動回路に変化を引き起こす SMA の初期事象です 77、78、79。 SMA は、運動ニューロンの変性がシナプス前 NMJ で始まり、細胞体に進行する逆行性の神経病理です 15。 重度の SMA マウス モデルでは、運動ニューロンの数は出生時には正常ですが、生後 3 日目頃には 580、81 に減少します。 出生後の NMJ の成熟は、生後最初の 3 ～ 4 週間で起こります。 この期間中に、NMJ は拡大し、その形態は楕円形から穴あきプラークに変化し、プレッツェルのような形状に達します 82。 Cav3.2 電流は周産期の筋線維で高く、生後 3 ～ 4 週間で徐々に減少し、筋肉の再生と修復時を除いて成人の筋肉では検出されません 63。 この発達期は SMN に対する需要が高く、SMN 欠損によって引き起こされる運動表現型が SMN ベースの治療によって救われる時期です 83,84,85。 これは、SMN に依存しない治療法によって疾患の表現型が改善される場合でもあります 12,43,86,87,88。

アグリン/LRP4/MuSK 経路が刺激されると、SMA および筋萎縮性側索硬化症 (ALS) が改善されます 89。 アグリンは、シナプス後 NMJ 生物学における重要な分子です。 アグリンアイソフォームの変化は、NMJ の形成、成熟、安定性に影響を与えます 23。 Agrn 遺伝子には選択的スプライシングされた Y エクソンと Z エクソンがあります。 Z 部位を持つアイソフォーム (Z+) は NMJ でシナプス形成性を示しますが、Z 部位を持たないアイソフォーム (Z-) は生体内で AChR クラスター化活性をほとんど持ちません 90。 運動ニューロンは Z+ アグリンを発現しますが、筋細胞は発現しません。 Z-アグリンには機能もあります。AChR リン酸化を調節し 91、AChR 遺伝子発現を刺激し 92,93、特定の条件下では AChR クラスター化を誘導する 60,94,95 ことができます。 Z-アグリンは、神経細胞接着分子、α-ジストグリカン、ラミニン、インテグリンなどの筋管細胞表面タンパク質に結合できます28、96、97、98、99。 Z+ アグリンもこれらのタンパク質に結合できますが、α-ジストグリカンは Z+ アグリンよりも Z- アグリンに強く結合します。 さらに、Y 部位は相互作用を変化させ、Y-Z- アグリンは α-ジストログリカン 90 に対して最も高い結合を示します。 フルナリジンで調節される Y 部位は、α-ジストログリカンの活性が SMA 筋肉の反応に関与していることも示唆しています。

生後 10 日目では、各骨格筋の成熟度は大きく異なります。 胎児期の MyHC は出生後もしばらく存続します。 ヒラメ筋は、足底筋 (30%) や脛骨筋 (20%) よりも胚線維 (60%) の割合が大きいため、あまり成熟していない筋肉です 43。 2 つの Agrn プロモーターは、それぞれ分泌型または膜貫通型アイソフォームをコードする NtA または Tm の最初のエクソンを持つ転写物を生成します。 運動ニューロンと筋線維は両方とも、ラミニン結合ドメインをコードする NtA エクソンを発現します 27。 SMA マウス由来の Smn 欠損運動ニューロンはラミニンに応答しないことが示されており 100、これは NtA アグリンの減少と一致しています。 SMA筋肉でも観察された顕著なNtA減少は、両方の細胞型での発現の変化を示しています。 NtA エクソンと Tm エクソンは SMA 筋肉内で同様に影響を受けるわけではなく、発達/筋肉特異的な方法で薬剤に対して異なる反応を示し、より成熟した SMA 脛骨筋は対照のように動作します。 インビボでの Tm エクソンは、ほぼ独占的にニューロンによって発現され 27 、筋肉では筋線維を神経支配するニューロンによって発現されます。 SMA 筋間では異なる Tm エクソンレベルが観察されており、骨格運動ニューロン 101 および/または筋線維からの逆行性信号 14 の違いが示唆されています。

閾値Tmエクソンレベルは、足底SMAおよび脛骨筋におけるNMJサイズに対するフルナリジンの効果と相関しているが43、それが足底SMAでどのように起こるかを説明するには追加のメカニズムを考慮する必要がある（ビヒクルとフルナリジンの間のTmレベルは同様）。 Y 部位は、中枢神経系の興奮性シナプス様の特殊化において Tm-アグリンを調節することが示されています 34。 これらの著者らは、シナプス後膜でタンパク質をクラスター化するには、Tm-アグリンとLRP4の間接的な相互作用が必要であると提案した。 Cav3.2 が間接的な相互作用を仲介する可能性があります。 他の研究では、インテグリン-β1がアグリンとα-ジストログリカンの間の相互作用を媒介できることが示されています28,57。 したがって、Cav3.2 が初期のシナプス後 NMJ 分化におけるアグリン共受容体である可能性があると推測したくなります。

Cacna1h 遺伝子（Cav3.2 をコードする）に関しては、SMA マウスでは Cacna1h 遺伝子の U12 依存性イントロン スプライシングが変化しています 47。 運動ニューロン疾患 ALS および重度の先天性筋萎縮症は、危険因子として遺伝的 Cacna1h 変異体と関連しています 102、103、104、105。 興味深いことに、他のタイプのカルシウムチャネル、つまりP/QタイプはMuSKの局在化と活性化を制限し、筋線維のシナプス外ドメインにおけるAChRのクラスター化を妨げます106。 T 型カルシウム チャネルのブロッカーが Cacna1h の発現を RNA およびタンパク質レベルで調節できることは興味深いです。 その理由は、Cav3 チャネルに対する薬剤の選択性が低いことである可能性があります 107。 T 型チャネルの阻害がフルナリジンの効果を部分的に説明していると推測したくなります。 Cav3.2電流阻害に対するフルナリジンの持続的な作用は、このチャネルの役割を裏付けています（補足図7）。 フルナリジンは、SMA 足底筋および脛骨筋の NMJ 欠陥に対抗する細胞内 Ca2+ レベルを変化させることにより、Cacna1h 発現のフィードバック ループを促進する可能性があります。 これは、SMA および ALS108 における RNA 代謝の変化の役割、および RNA スプライシングに対するフルナリジンの効果と一致しています 45。 我々の結果は他のヒトの疾患にも広く関連しており、ドミナントネガティブなCav3.2変異によって引き起こされるチャネル症に罹患した若い患者においてフルナリジンが有害である可能性があることを示唆している109。

カルシウムは骨格筋生物学における重要な調節因子です。 AChR クラスターの形成と維持には、細胞内および細胞外のカルシウムが関与しています 110,111。 マウスの筋肉では、Cav3.2 電流は胎生期 E16 日目付近でピークに達し、これは胎生後期の NMJ 成熟段階と一致します。 実際、神経性AChRクラスターはE11〜12.5に存在し、その後神経支配が起こり(E12.5〜E14)、神経支配クラスターはE14〜E17で分散し、神経支配されたクラスターのみが筋線維上に残ります20。 筋形成もこの時期に起こります。 E14.5 から誕生まで、筋芽細胞は一次筋線維に接着および融合して二次筋線維を形成します 112。 Cav3.2 電流は、筋芽細胞が融合して筋管を形成するときに in vitro で活性化されます 113。 これは、SMA マウスの筋肉サイズの減少を説明できる可能性があります。 SMA ヒラメ筋および足底筋の筋線維数の減少 43 は、Cacna1h RNA レベルの減少と相関しています。 フルナリジンは線維のサイズと数を増加させてSMAヒラメ筋の萎縮を軽減しますが、足底SMAの萎縮を矯正するには線維のサイズのみです43。 出生後の筋肉の成長は通常、線維面積の増加によって起こりますが、線維数の増加によっては起こりません20,114。 これらの観察は、本明細書で見られるように、筋線維の種類およびそれぞれのCav3.2の発現の違いを示している可能性がある。 ヒラメ筋には、遅いタイプ I 線維と速いタイプ II 線維が 50% ～ 50% の割合で存在します。 足底筋と脛骨筋には、出生後の発育中にほぼ完全に消失する I 型線維が少量 (10 ～ 20%) 含まれています。 安静時のカルシウムレベルは、速繊維よりも遅繊維の方が高くなります。 したがって、カルシウムの恒常性を制御するタンパク質のレベルの違いにより、カルシウム過渡現象はどちらの線維でも異なる影響を及ぼします。 カルシウムは、カルモジュリン調節ホスファターゼ カルシニューリンを活性化し、カルシウム依存性プロテアーゼを活性化します。 遅い筋線維では、カルシニューリンが遅い遺伝子プログラムを制御する転写因子NFATc1の核移行を調節します。 さらに、Cav3.2 を介したカルシウム流入の増加は、心臓カルシニューリン/NFAT 肥大性シグナル伝達を誘導します 115。 SMA50 ではカルシウムの取り扱いが変化していることを考えると、フルナリジンは将来的にまだ特定されていない他の筋肉遺伝子の発現を調節する可能性があります。

Cav3.2 が C2C12 筋管の LRP4 に近接して見られるという我々の観察は、周産期発育中の NMJ 付近に Cav3.2 が局在する可能性があるという疑問を引き起こします。 Cav3.2 が NMJ の近くに局在する理由は推測できますが、まだ完全には理解されていません。 Cav3.2 の興味深い特徴は、その細胞質 C 末端に PDZ 結合ドメインが存在することです 116。 PDZ タンパク質は、カルシウム チャネルの活性を制御し、細胞膜密度を調節し、下流のシグナル伝達経路に影響を与える可能性があります 117。 神経細胞の一酸化窒素合成酵素 (nNOS) および α-シントロフィン 118,119、MAGI-1c120、および RING フィンガー 3 (PDZRN3) を含む PDZ ドメイン 121 など、いくつかの PDZ 足場タンパク質がシナプス後 NMJ で見つかります。 したがって、Cav3.2のNMJ局在は、nNOSのPDZドメインがCav3.2122のPDZ結合ドメインとインビトロで相互作用するという以前の報告によって説明される可能性がある。 これは、SMA および ALS の場合に特に興味深い。患者の筋生検では、nNOS の免疫染色が萎縮線維の筋鞘で減少/消失し、SMA 生検では肥大線維 (神経支配を示す) で保存されている 123,124。 この結果は、SMA マウスの筋肉に対するフルナリジンの効果に関して多くの点で注目に値します。 nNOS 活性はカルシウム恒常性を調節し 125、生体内での AChR クラスター化を促進し、NMJ を拡大します 126。 NMJ の発生に関しては、AChR クラスター化の Wnt 誘導は複雑です。 RNA分析により、フルナリジンによっても変化せず、AChRサブユニットおよび下流のYAP標的によっても変化しない、C2C12筋管におけるWnt4およびWnt9a発現が同定された（補足図5および6）。 フルナリジン誘発性AChRクラスタリングにおけるWntの役割を探ることで、将来さらなる洞察が得られる可能性がある。 出生後の筋経路の調節不全を伴う SMA マウス胚 128 の骨格筋における経路の調節不全がほとんどない 37,88,129,130​​ ことを考慮すると、我々の発見は、SMA マウスの新生児発育中の薬物効果を調査することの重要性を示しています。 フルナリジンに対する反応をより深く理解することで、既存の治療法を運動ニューロン疾患に対する併用療法に拡張できる可能性があります。

C2C12筋細胞を、20％ウシ胎児血清（FCS）、ペニシリンおよびストレプトマイシン（100単位/ml）を添加したDMEM-glutamax中のTPP培養皿上で増殖させ、2％ウマ血清を含むDMEM-glutamax中で分化させた。 分化培地中で6日後、図2aに概略的に示すように、筋管をフルナリジン（LopacライブラリーL6912についてSigma-Aldrichが推奨する4μM、Cav3.2カルシウム電流IC50）またはDMSO（1μl/ml）で一晩処理しました。 。 ブロッキング抗体(文献によれば1:100)を使用した実験では、分子の1時間前にブロッキング抗体を筋管に加えました。 蛍光顕微鏡検査のために、筋管をＰＢＳですすぎ、０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中の３％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて室温で１５分間固定し、ＰＢＳですすいだ。 AChRクラスターは、Alexa Fluor 488または555結合α-ブンガロトキシン(2μg/ml、Molecular Probes)を使用して視覚化されました。 ウェスタンブロッティングでは、総タンパク質抽出物を Tris-Tricine ランニングバッファー中の 10% ProSieve 50 ポリアクリルアミドゲル (FMC Bioproducts、メイン州ロックランド) で分離し、PVDF 膜 (Millipore) に転写し、補足表 1 に記載されている抗体とインキュベートしました。 HRP結合二次抗体とのインキュベーションの洗浄ステップでは、タンパク質を化学発光(Amersham ECL、GE Healthcare)を使用して視覚化し、ImageJのゲル分析を使用して定量した。 電気生理学的記録のために、hCaV3.2を安定的に発現するHEK293を、10% FBS、1 mM L-グルタミン、1 mM ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した高グルコースDMEMで培養し、800 μg/ml ジェネティシン G418で仕上げました。

電気生理学的記録のために、トリプシン処理した細胞を800 rpmで4分間遠心分離し、パッチクランプ細胞外溶液に再懸濁しました（約350,000細胞ml-1）。 全細胞記録を使用して、Cav3.2 発現 HEK293 細胞に対するフルナリジンの影響を調査しました。 自動パッチクランプ記録は、Nanion (ドイツ、ミュンヘン) の SyncroPatch 384PE を使用して実行されました。 中抵抗の単一穴を備えたチップ (n = 384) を電気生理学的記録に使用しました。 パルス生成とデータ収集は、PatchControl384 v1.9.7 ソフトウェア (Nanion) および Biomek インターフェース (Beckman Coulter) を使用して実行されました。 全細胞記録は、Nanion の推奨手順に従って実施されました。 細胞は、60 RPM の振盪速度で 10 °C のセルホテルリザーバーに保存されました。 実験開始後、細胞の捕捉、封止、全細胞の形成、液体の塗布、記録、データ収集がすべて順次かつ自動的に実行されました。 含まれる細胞内溶液 (mM): 10 CsCl、110 CsF、10 NaCl、10 EGTA、および 10 HEPES (pH 7.2、浸透圧 280 mOsm)、および含まれる細胞外溶液 (mM): 60 NMDG、80 NaCl、4 KCl 、10 CaCl2、1 MgCl2、5 グルコースおよび 10 HEPES (NaOH で pH 7.4)。 全細胞実験は、室温（18〜22℃）で-100 mVの保持電位で実行されました。 電流は 20 kHz でサンプリングされました。 薬理学的アッセイでは、0.3% ウシ血清アルブミンを添加した細胞外液でフルナリジン溶液をさまざまな濃度で調製し、事前に確立されたプレート計画に従って 384 ウェル化合物プレートに分配しました。 化合物プレート内のこの分布は、その後の分析方法が過度に複雑になるため、ランダム化できませんでした。 パッチクランプ記録ウェル内で、30 ～ 60 µL の外部溶液を加えて、最終報告濃度および 90 µL の試験容量に達するように、実用化合物溶液を 3 倍に希釈しました。 対照群の場合、ビヒクル溶液は、0.3% BSAおよび0.1% DMSOを含む細胞外溶液でした(これは、10μMフルナリジン溶液中のDMSO濃度と同様でした)。 フルナリジンの効果は、50 ms –100 mV の電位保持期間とそれに続く -10 mV での 400 ms パルスを含むシングル ステップ プロトコルで、10 分間の適用時間の間ずっと測定されました。 この単一ステップのプロトコルを 10 秒間隔で繰り返しました。

動物実験は、ARRIVE ガイドラインと、実験動物の管理と使用に関するヨーロッパおよびフランスのガイドライン (2010/63/EU) を尊重してパリ大学動物保護委員会 (CEEA 34) によって承認されたプロトコール (参照番号) に従って実施されました。 01246.02およびB75-06-07。 台湾の SMA マウスには、記載されているように、出生時からフルナリジン (500 μg/ml、1 μl/g) またはビヒクル (生理食塩水中 1% DMSO) のいずれかを毎日注射しました 43。 SMA マウスは FVB/NRj バックグラウンド (Janvier、Le Genest-St-Isle、France) であり、記載されているように 10 世代戻し交配されています。 各動物に番号を割り当て、特に明記しない限り、実験は遺伝子型、治療、分子および細胞の研究については盲検化して実施した。 グループの割り当ては分析のために開示されました。 除外基準は使用されませんでした。 女性と男性の両方が研究に参加しました。 重症台湾 SMA モデル (Smnko/ko; SMN2tg/0) および対応する対照ヘテロ接合マウス (Smnko/wt; SMN2tg/0) マウスを同腹で産生しました。 以前の結果 43 に基づいて、使用する動物の数を最小限に抑えるために、実験グループごとに 3 匹のマウスを研究しました。 ４つのグループは、ビヒクルおよびフルナリジンで処置された対照マウスおよびＳＭＡモデルマウスであり、合計５９匹のマウスであった。 マウスは、PCR プライマー S1、S2、H1、2B、および 2F131 を使用して遺伝子型特定されました。 簡単に説明すると、1 μl DNA (20 ng)、5 μl 5X グリーン GoTaq flexi バッファー、2.5 μl 25 mM MgCl2 (最終 2.5 mM)、1 μl 10 mM dNTP 混合物 (各 dNTP 2.5 mM、200 1.5 μl 10 μM S2 フォワードプライマー (最終 0.6 μM)、0.75 μl 10 μM 2F フォワードプライマー (最終 0.3 μM)、0.75 μl 10 μM S1、H1、2B リバースプライマー (最終 0.3 μM)、および 0.15 μl GoTaq DNAポリメラーゼ（プロメガ）。 増幅条件は次のとおりでした：95℃で5分間、その後95℃で30秒間、58℃で1分間、72℃で45秒間を33サイクル、最終伸長ステップは72℃で5分間でした。 PCR 産物 S2-S1 (1150 bp)、S2-H1 (950 bp) および 2F-2B (478 bp) を 1% アガロースゲルで分析しました。 SMA 変異体とそのヘテロ接合体の同腹子をペントバルビタール (64 mg/kg) の腹腔内注射によって麻酔し、P5 または P10 で断頭しました。 3 つの骨格筋 (ヒラメ筋、足底筋、脛骨筋) を解剖し、瞬間冷凍し、-80 °C で保存しました。 筋肉凍結切片 (10 μm) に対する免疫蛍光実験は、以前に詳述したように実行されました 43。 簡単に説明すると、切片を 4% PFA を含む PBS で 20 分間固定し、20% FCS または 4% BSA で 30 分間ブロックし、一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。 PBS-Tween (0.1%)中で1時間後、切片を二次抗体とともに2時間インキュベートしました。 ビスベンズイミド (または DAPI) 染色および洗浄後、切片をフルオロマウント G 溶液でマウントしました。 使用した抗体を補足表 1 に示します。

画像は、落射蛍光顕微鏡システム (AxioObserver Z1、ZEISS) に取り付けられた ORCA Flash 2.8 カメラ (Hamamatsu Photonic) を使用して撮影されました。 ZEN ソフトウェアと ImageJ ソフトウェアをそれぞれ画像の取得と分析に使用しました。 簡単に言うと、関心領域 (ROI) がランダムに選択され、ImageJ で明視野チャネル画像を使用して手動で描画されました。 筋線維の蛍光強度分析では、まず閾値レベルを調整してバックグラウンドシグナルを除去し、Cav3.2標識筋線維の平均グレー値をI型標識線維または非標識線維（おそらくII型）の線維について測定しました。 ) マウスの各グループについて。

C2C12 筋管内の AChR クラスターのサイズは、ランダムに選択された 20 倍の顕微鏡視野 (実験あたり 40 視野、n ≥ 3 の独立した実験) または 1 つあたり 100 本の線維からの AChR 凝集体 (≥ 6 ～ 10 μm) の測定によって、ImageJ で決定されました。実験 (n = 3)。

in situ 近接ライゲーション アッセイ (PLA) は、記載どおりに実行されました 132。 簡単に言うと、C2C12 細胞を上記のように固定し、透過処理しました。 一次抗体 (補足表 1) を抗体希釈液 (DuolinkII キット、Sigma-Aldrich) で希釈し、4 °C で一晩インキュベートしました。 陰性対照は、単一の一次抗体を使用して構成されました。 細胞を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎを含むトリス緩衝生理食塩水中で５分間、２回洗浄した。 PLA プローブ (マウス PLUS およびウサギ MINUS) を 37 °C で 1 時間インキュベートしました。 その後のステップは、検出試薬 Orange を使用して実行されました。 シグナルは蛍光顕微鏡でドットとして観察され、ImageJ で分析されました。

Trizol 試薬 (Ambion) を使用して組織および細胞培養物から全 RNA を抽出し、RQ1 RNase-free DNase (Promega) で処理しました。 1 µg の RNA を使用して、snRNA 解析には miScript II RT キット (Qiagen) を使用し、他の遺伝子には Superscript III (Invitrogen) を使用して cDNA を生成しました。 定量的リアルタイム PCR は、Applied Biosystems 7500 fast system または BioRad CFX384 のいずれかで、SYBR Green ROX mix (Thermo Scientific) を使用して補足表 2 に記載のプライマーを使用して 3 回実行しました。 正規化された発現レベルは、ΔΔCt 法に従って計算されました。 snRNA、5 S、5.8 S、Rpl13a、Ppia、Gapdh、Myh4、および Z+ Agrn プライマーとそれらの分析は以前に記載されています 43。 追加のプライマーは、ユーロフィン (eurofinsgenomics.eu) の無料プライマー設計ツールを使用して設計され、MIQE ガイドラインに従って検証されています。

少なくとも 3 つの独立した実験は、平均値 ± SD または SEM として表示されました。 統計分析は、ノンパラメトリックなKruskal Wallisに続いて、Dunnの多重比較ランク検定または二元配置分散分析、その後にTukeyの多重比較検定またはStudent t'test (GraphPad)を使用して実施されました。 使用されたテストは図の凡例に示されています。 有意閾値は5%でした。

現在の研究中に行われた詳細な計算および/または現在の研究中に分析された詳細な計算は、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

Lefebvre, S. et al. 脊髄性筋萎縮症を決定する遺伝子の同定と特徴付け。 セル 80、155–165 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lefebvre, S. et al. 脊髄性筋萎縮症における重症度とSMNタンパク質レベルの相関関係。 ナット。 ジュネット。 16、265–269 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

カウチ、RJ SMN、ジェミンズ: 「私たちは家族です」それとも家族ですか？ Gemins と脊髄性筋萎縮症タンパク質 SMN とのパートナーシップに関する洞察。 BioEssays 32、1077–1089 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Singh, RN、Howell, MD、Ottesen, EW & Singh, NN 生存運動ニューロンタンパク質の多様な役割。 ビオチム。 生物物理学。 アクタジーンレギュラー。 メカ。 1860、299–315 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

BR、Zhang、Z. & Dreyfuss、G. SMN 複合体: 組織と機能。 脊髄性筋萎縮症：疾患のメカニズムと治療（Sumner、CJ、Paushkin、S.、Ko、CP編）。 （アカデミックプレス、2016）。

Lorson, CL & Androphy, EJ SMA 決定遺伝子 SMN に必須のエクソンを組み込むには、エクソン エンハンサーが必要です。 ハム。 モル。 ジュネット。 9、259–265 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Burghes、AHM & Beattie、CE 脊髄性筋萎縮症: 生存運動ニューロンタンパク質のレベルが低いと、運動ニューロンが病気になるのはなぜですか? ナット。 神経科学牧師。 10、597–609 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calucho、M. et al. SMA タイプと SMN2 コピー数の相関関係を再考察: 625 人の血縁関係のないスペイン人患者の分析と 2,834 件の報告症例の編集。 神経筋。 障害。 28、208–215 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Finkel、RS & Fishbeck、KH おそらく、遺伝子治療では良いことが多すぎるのでしょう。 ナット。 神経科学。 24、901–902 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

グローエン、EJN、タルボット、K.、ギリングウォーター、TH 脊髄性筋萎縮症の治療の進歩: 約束と課題。 ナット。 ニューロール牧師。 14(4)、214–224 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

ダラス、BT 他。 リスディプラム治療を受けた 1 型脊髄性筋萎縮症の乳児と歴史的対照の比較。 Ｎ．Ｅｎｇｌ． J.Med. 385、427–435 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mercuri, E.、Pera, MC、Scoto, M.、Finkel, R. & Muntoni, F. 脊髄性筋萎縮症 - 治療時代の洞察と課題。 ナット。 ニューロール牧師。 16、706–715 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

カンザス州オジャラ、EJ リーディッチ、CJ ディドナート、SD メリニー 治療法を求めて: 脊髄性筋萎縮症の進行を変える治療法の開発。 脳科学。 11、194 (2021)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Braun, S.、Croizat, B.、Lagrange, MC、Warter, JM & Poindron, P. 脊髄性筋萎縮症における培養における構成的筋肉異常。 ランセット 345、694–695 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

シフエンテス・ディアス、C.ら。 脊髄性筋萎縮症マウスモデルにおける運動終板での神経フィラメントの蓄積と軸索の発芽の欠如。 ハム。 モル。 ジュネット。 11、1439–1447 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Martínez-Hernández, R.、Bernal, S.、Alias, L. & Tizzano, EF 筋関与の初期マーカーの異常は、脊髄性筋萎縮症における筋形成の遅延を裏付けています。 Ｊ．ニューロパトール。 経験値ニューロール。 73、559–567 (2014)。

論文 PubMed Google Scholar

ビオンディ、O.ら。 運動誘発性の NMDA 受容体の活性化は、2 型脊髄性筋萎縮症モデルマウスの運動単位の発達と生存を促進します。 J. Neurosci. 28、953–962 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

苅谷 伸 ほか SMNタンパク質の減少は、脊髄性筋萎縮症のマウスモデルにおける神経筋接合部の成熟を損なう。 ハム。 モル。 ジュネット。 17、2552–2569 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kong、L. et al. 脊髄性筋萎縮症マウスにおけるシナプス小胞放出の障害と神経筋接合部の未熟。 J. Neurosci. 29、842–851 (2009)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sanes、JR & Lichtman、JW シナプス後装置の誘導、組み立て、成熟、および維持。 ナット。 神経科学牧師。 2、791–805 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

西宗 宏 & 重本 和也：健康と病気における神経筋接合部の実践的な解剖学。 ニューロール。 クリン。 36、231–240 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, L.、Xiong, WC & Mei, L. 神経筋接合部の形成、老化、障害。 アンヌ。 Rev. Physiol. 80、159–188 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Burgess、RW、Nguyen、QT、Son、YJ、Lichtman、JW & Sanes、JR 神経および筋肉由来のアグリンのオルタナティブ スプライスされたアイソフォーム: 神経筋接合部におけるそれらの役割。 ニューロン 23、33–44 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

発達中のCNSにおけるKröger, S. & Schröder, JE Agrin: シナプスオーガナイザーの新しい役割。 ニュース フィジオ。 科学。 17、207–212 (2002)。

PubMed Google Scholar

ルイジアナ州ティンティニャック、HR ブレナーおよびマサチューセッツ州リュエッグ 神経筋接合部の発達と機能を調節するメカニズム、および筋肉消耗の原因。 生理。 改訂 95、809–852 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ruegg, MA & Bixby, JL アグリンは、脊椎動物の神経筋接合部におけるシナプスの分化を調整します。 トレンド神経科学。 21、22–27 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bezakova, G. & Ruegg, MA アグリンの役割に関する新たな洞察。 ナット。 モル牧師。 細胞。 バイオル。 4、295–308 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Burgess, RW、Dickman, DK、Nunez, L.、Glass、DJ & Sanes、JR アグリンとニューロンの相互作用を担うマッピング部位。 Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． 83、271–284 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

手塚 哲 ほか MuSK 活性化因子アグリンは、出生後の神経筋シナプスの維持に不可欠な別の役割を持っています。 手順国立アカド。 科学。 USA 111、16556–16561 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Bassat、E. et al. 細胞外マトリックスタンパク質アグリンは、マウスの心臓の再生を促進します。 ネイチャー 547、179–184 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Campagna (JA)、Rüegg (MA) & Bixby (JL) アグリンは、インビトロでの運動ニューロンの分化誘導「停止シグナル」です。 ニューロン 15、1365–1374 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chang, D.、Woo, JS、Campanelli, J.、Scheller、RH & Ignatius、MJ アグリンは神経突起の伸長を阻害しますが、胎児の運動ニューロンと感覚ニューロンの付着を促進します。 開発者バイオル。 181、21–35 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bixby, JL、Baerwald-De la Torre, K.、Wang, C.、Rathjen, FG & Rüegg, MA アグリンの N 末端半分にある神経抑制ドメイン。 J. Neurobiol. 50、164–179 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Handara, G. & Kröger, S. 選択的スプライシングと細胞内ドメインは、CNS ニューロンの発達における興奮性および抑制性のシナプス様の特殊化の密度を差動的に調節する TM アグリンの能力を媒介します。 神経科学 419、60–71 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chakraborty, S. et al. 肝細胞癌における接着斑の完全性の調節におけるアグリンの発がん性の役割。 ナット。 共通。 6、6184–6190 (2015)。

論文 CAS PubMed ADS Google Scholar

Chakraborty, S.、Njah, K.、Hong, W. アグリンは腫瘍微小環境における血管新生を媒介します。 トレンド キャンサー 6、81–85 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang、Z.ら。 シナプス形成遺伝子の調節不全は、脊髄性筋萎縮症における運動ニューロンの病理に先行します。 手順国立アカド。 科学。 USA 110、19348–19353 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Tisdale, S.、Van Alstyne, M.、Simon, CM、Mentis, GZ & Pellizzoni, L. SMN は、U7 snRNP を通じて神経筋接合部の完全性を制御します。 Cell Rep. 40、111393 (2022)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, JK, Caine, C., Awano, T., Herbst, R. & Monani, UR NMJ オーガナイザーであるアグリンの運動ニューロンの補充は、モデルマウスにおける脊髄性筋萎縮症の表現型の重症度を調節します。 ハム。 モル。 ジュネット。 26、2377–2385 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ボイド、M.ら。 アグリン機能の増加は、脊髄性筋萎縮症における筋萎縮と運動障害に拮抗します。 フロント。 細胞。 神経科学。 12、17 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

カイファー、KA et al. AAV9-DOK7遺伝子治療は、Smn 2B/-SMAモデルマウスの疾患の重症度を軽減します。 生化学。 生物物理学。 解像度共通。 530、107–114 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Feng、Z.ら。 筋特異的キナーゼ (MuSK) の活性化により、脊髄性筋萎縮症 (SMA) のデルタ 7 マウス モデルにおける神経筋欠陥が減少します。 内部。 Ｊ．Ｍｏｌ． 科学。 22、8015–8027 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sapaly, D. et al. 小分子フルナリジンは、脊髄性筋萎縮症のマウスモデルにおいて核カハール体のSMNタンパク質と運動機能を増加させます。 科学。 議員第8号、2075年（2018年）。

論文 PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

サンティ、ＣＭら。 422 種類の神経弛緩薬による T 型カルシウム チャネルの示差阻害。 神経科学 22、396–403 (2002)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ユニス、I.ら。 迅速応答スプライシング レポーター スクリーニングにより、構成的スプライシングおよび選択的スプライシングの異なる制御因子が同定されます。 モル。 細胞。 バイオル。 30、1718–1728 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

バウマー、D. et al. 選択的スプライシング現象は、脊髄性筋萎縮症のマウスモデルにおける病理の後期の特徴です。 PLoS ジュネット。 5、e1000773 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

TK, Doktor et al. 脊髄性筋萎縮症のマウスモデルの RNA シーケンスにより、U12 依存性イントロンのスプライシングにおける組織全体の変化が明らかになりました。 核酸研究所 45、395–416 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jablonka, S.、Beck, M.、Lechner, BD、Mayer, C. & Sendtner, M. 軸索末端における欠陥のある Ca2+ チャネルのクラスタリングは、脊髄性筋萎縮症における運動ニューロンの興奮性を妨げます。 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． 179、139–149 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ruiz, R.、Casañas, JJ、Torres-Benito, L.、Cano, R. & Tabares, L. 重度脊髄性筋萎縮症マウスの神経終末における細胞内 Ca2+ 恒常性の変化。 J. Neurosci. 30、849–857 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wirth, B. 脊髄性筋萎縮症: 課題の中に解決策があります。 トレンド神経科学。 44、306–322 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang、Z.ら。 SMN欠損は、snRNAのレパートリーに組織特異的な混乱を引き起こし、スプライシングに広範な欠陥を引き起こします。 セル 133、585–600 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, D. et al. アグリンに応答したアセチルコリン受容体クラスタリングにおける筋肉特異的受容体チロシンキナーゼのエンドサイトーシス。 J. Neurosci. 28、1688–1696 (2008)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

リン、SS et al. ダイナミン-2 は、シナプス後細胞骨格の組織化と神経筋接合部の発達を調節します。 Cell Rep. 33、108310 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Chen, PJ、Zelada, D.、Belhasan, DC、Akaabune, M. α-ジストロブレビンのリン酸化は、αcap の蓄積とアセチルコリン受容体の安定性に不可欠です。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 Rev. 295、10677–10688 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martinez-Pena および Valenzuela, I.、Mouslim, C. & Akaabune, M. インビボでの哺乳動物の神経筋接合部におけるカルシウム/カルモジュリンキナーゼ II 依存性アセチルコリン受容体サイクリング。 J. Neurosci. 30、12455–12465 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sapaly, D. et al. 脊髄性筋萎縮症患者の線維芽細胞に含まれる小分子フルナリジンは、SMN複合体のジェミン成分と、運動ニューロン疾患に関連するRNA結合タンパク質であるTDP43に影響を与えます。 フロント。 モル。 生物科学。 7、55（2020）。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Martin、PT および Sanes、JR インテグリンはアグリンへの接着を媒介し、アグリンシグナル伝達を調節します。 開発 124、3909–3917 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gee, SH、Montanro, F.、Lindenbaum, MH、Carbonetto, S. ジストロフィン関連糖タンパク質であるジストグリカン-a は、機能的なアグリン受容体です。 セル 77、675–686 (1994)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jacobson, C.、Côté, PD、Rossi, SG、Rotundo, RL & Carbonetto, S. ジストログリカン複合体は、神経筋接合部におけるアセチルコリン受容体クラスターの安定化とシナプス基底膜の形成に必要です。 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． 152、435–450 (2001)。

Campanelli, JT、Hoch, W.、Rupp, F.、Kreiner, T. & Scheller, RH アグリンは、細胞接触誘発性のアセチルコリン受容体のクラスター化を媒介します。 セル 67、909–916 (1991)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Patel, AA & Steitz, JA スプライシングダブル: 2 番目のスプライセオソームからの洞察。 ナット。 モル牧師。 細胞。 バイオル。 4、960–970 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

オスマン、EYら。 マイナー snRNA 遺伝子送達は、SMA 運動ニューロン上の固有受容シナプスの損失を改善します。 JCI インサイト 5、e130574 (2020)。

論文 PubMed Central Google Scholar

Gonoi, T. & Hayase, S. マウス骨格筋における一過性カルシウムチャネルの出生後消失: 除神経と培養の影響。 Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 401、617–637 (1988)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Canto-Bustos、M. et al. 成体カメの脊髄運動ニューロンにおける T 型 Ca2+ チャネルの機能発現。 PLoS ONE 9、e108187 (2014)。

論文 PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Zhang、Z. & David、G. マウス末梢運動軸索のランビエ節における刺激誘発性 Ca(2+) 流入。 Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 594、39–57 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ベルナル・シエラ、YA 他末梢神経系における Cav3.2 T 型カルシウム チャネル発現の遺伝的追跡。 フロント。 モル。 神経科学。 10、70 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ブラウンスタイン、TH et al. ラットの腸間膜末端細動脈における局所および遠隔のカルシウム応答におけるカルシウムチャネル。 J.バスク。 解像度 46、138–151 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pollari, E.、Goldsteins, G.、Bart, G.、Koistinaho, J. & Giniatullin, R. 筋萎縮性側索硬化症における神経筋接合部の変性における酸化ストレスの役割。 フロント。 細胞。 神経科学。 8、131 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, G.、Chen, J.、Jing, G.、Shalev, A. カルシウムチャネル遮断薬によるβ細胞喪失と糖尿病の予防。 糖尿病 61、848–856 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ウェン、Ｙら。 サテライト細胞の枯渇後の運動に応答した筋核の転写ダイナミクス。 iScience 24、102838 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Hayhurst, M.、Wagner, AK、Cerletti, M.、Wagers, AJ & Rubin, LL 運動ニューロンタンパク質の生存レベルが低い骨格筋サテライト細胞における細胞自律性欠陥。 開発者バイオル。 368、323–334 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

メッカ、J. et al. 脊髄性筋萎縮症の生理病理学における筋衛星細胞の役割。 ニューロムスク。 障害。 27(2)、S136 (2017)。

記事 Google Scholar

ニコール、S.ら。 無傷の衛星細胞は、分化した骨格筋における Smn 遺伝子欠損に対する顕著な保護につながります。 Ｊ．Ｃｅｌｌ． バイオル。 161、571–582 (2003)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kawamoto, E.、Tama越, K.、Ra, SG、Masuda, H. & Kawanaka, K. 固定化は、ラット骨格筋におけるインスリン抵抗性とともにチオレドキシン相互作用タンパク質の遺伝子発現を急速に誘導します。 Ｊ．Ａｐｐｌ． 生理。 125、596–604 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Murray, LM、Talbot, K. & Gillingwater, TH 総説: 運動ニューロン疾患における神経筋シナプスの脆弱性: 筋萎縮性側索硬化症および脊髄性筋萎縮症。 ニューロパトール。 応用ニューロビオール。 36、133–156 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gromova, A. & La Spada, AR 調和の喪失: 運動ニューロン疾患における神経筋接合部における細胞間コミュニケーション。 トレンド神経科学。 43、709–724 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

メンティ、GZ et al. 脊髄性筋萎縮症のマウスモデルにおける感覚運動結合の初期機能障害。 ニューロン 69、453–467 (2011)。

記事 Google Scholar

フレッチャー、EV 他脊髄性筋萎縮症では、感覚シナプス興奮の低下により、Kv2.1 を介して運動ニューロンの機能が損なわれます。 ナット。 神経科学。 20、905–916 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vukojicic、A. et al. 古典的補体経路は、発生中およびSMAにおける脊髄運動回路のミクログリア依存性リモデリングを媒介します。 Cell Rep. 29、3087-3100.e7 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

モナニ、UR 他ヒト動原体生存運動ニューロン遺伝子 (SMN2) は、Smn(-/-) マウスの胎児致死性を回復し、脊髄性筋萎縮症のマウスをもたらします。 ハム。 モル。 ジュネット。 9、333–339 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Buettner、JM et al. 中枢性シナプトパチーは、脊髄性筋萎縮症マウスモデル全体に​​わたる運動回路病理の最も保存された特徴です。 iScience 24、103376 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Shi、L.、Fu、AKY & Ip、N. 脊椎動物の神経筋接合部の成熟と維持の根底にある分子機構。 トレンド神経科学。 35、441–453 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Besse, A. et al. ニューロンに限定された AAV9 媒介 SMN 発現では、マウスの脊髄性筋萎縮表現型は回復しません。 モル。 それで。 28、1887–1901 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim、JK & Monani、UR 乳児脊髄性筋萎縮症を治療するために SMN タンパク質を増強します。 ニューロン 97、1001–1003 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Tisdale, S. & Pellizzoni, L. 脊髄性筋萎縮症における RNA 処理機能障害。 脊髄性筋萎縮症：疾患のメカニズムと治療（Sumner、CJ、Paushkin、S.、Ko、CP 編）（Academic Press、2016）。

ムントーニ、F. et al. OLEOS試験においてオレソキシムで治療された2型および歩行不能な3型脊髄性筋萎縮症（SMA）患者の長期追跡調査。 神経筋。 障害。 30、959–969 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

Chaytow, H.、Faller, KME、Huang, YT & Gillingwater, TH 脊髄性筋萎縮症: 承認された治療法から個別化医療の将来の治療標的まで。 細胞代表医学。 2、100346 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meijboom、KE et al. マルチオミクスと薬物摂動プロファイルを組み合わせて、脊髄性筋萎縮症に対する筋肉特異的な治療法を特定します。 JCI インサイト 6、e149446 (2021)。

論文 PubMed Central Google Scholar

Rodríguez Cruz、PM、Cossins、J.、Beeson、D.、Vincent, A. 健康と病気における神経筋接合部: シナプス形成と恒常性を支配する分子機構。 フロント。 モル。 神経科学。 13、610964 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ゲゼマン、M. et al. アグリンの選択的スプライシングにより、ヘパリン、ジストグリカン、および推定上のアグリン受容体への結合が変化します。 ニューロン 16、755–767 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Meier, T.、Ruegg, MA & Wallace, BG 筋肉特異的なアグリン アイソフォームは、培養筋細胞における AChR ガンマおよびデルタ サブユニットのリン酸化を減少させます。 モル。 細胞神経科学。 11、206–216 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジョーンズ、G.ら。 基質に結合したアグリンは、培養哺乳類筋細胞においてアセチルコリン受容体イプシロンサブユニット遺伝子の発現を誘導します。 手順国立アカド。 科学。 USA 93、5985–5990 (1996)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

マイヤー、T.ら。 アグリンは、筋肉由来のニューレグリンの凝集により、筋肉におけるアセチルコリン受容体遺伝子の発現を仲介できます。 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． 141、715–726 (1998)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ferns, M. et al. RNA スプライシングは、培養筋管上のアグリン媒介アセチルコリン受容体のクラスター化活性を制御します。 ニューロン 8、1079–1086 (1992)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Khan、AA、Bose、C.、Yam、LS、Soloski、MJ & Rupp、F. アグリンによる免疫シナプスの生理学的調節。 サイエンス 292、1681–1686 (2001)。

論文 CAS PubMed ADS Google Scholar

Bowe, MA、Deyst, KA、Leszyk, JD & Fallon, JR Torpedo シナプス後膜からのアグリン受容体の同定と精製: ジストログリカンに関連するヘテロマー複合体。 ニューロン 12、1173–1180 (1994)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Burg, MA、Halfter, W. & Cole, GJ 発生中のニワトリ脳におけるプロテオグリカン発現の分析: 神経細胞接着分子と相互作用するヘパラン硫酸プロテオグリカンの特性評価。 J. Neurosci. 解像度 41、49–64 (1995)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Denzer, AJ、Brandenberger, R.、Gesemann, M.、Chiquet, M. & Ruegg, MA アグリンは、ラミニンを介して神経筋基底層に結合します。 Ｊ．Ｃｅｌｌ． バイオル。 137、671–683 (1997)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sugayama, J.、Bowen, DC & Hall, ZW ジストグリカンは神経と筋肉のアグリンを結合します。 ニューロン 13、103–115 (1994)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロソール、W.ら。 脊髄性筋萎縮症を決定する遺伝子産物である Smn は、軸索の成長と運動ニューロンの成長錐体におけるベータアクチン mRNA の局在を調節します。 Ｊ．Ｃｅｌｌ． バイオル。 163、801–812 (2003)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alkaslasi, MR、Piccus, ZE & Hareendran, S. 単核 RNA 配列決定により、成体マウス脊髄におけるコリン作動性ニューロンの種類の予想外の多様性が明らかになりました。 ナット。 共通。 12、2471–2484 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Carter, MT、McMillan, HJ、Tomin, A. & Weiss, N. 重度の先天性筋萎縮症に関連する複合ヘテロ接合性 CACNA1H 変異。 チャンネル 13、153 ～ 161 (2019)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Rzhepetskyy, Y.、Lazniewska, J.、Blesneac, I.、Pamphlett, R. & Weiss, N. 筋萎縮性側索硬化症に関連する CACNA1H ミスセンス変異は、Cav3.2 T 型カルシウム チャネル活性と網様視床ニューロンの発火を変化させます。 チャンネル (オースティン) 10、466–477 (2016)。

記事 Google Scholar

Steinberg, KM、Yu, B.、Kobolt, DC、Mardis, ER & Pamphlett, R. 症例に影響を受けていない両親トリオのエクソーム配列決定により、散発性 ALS における劣性遺伝的変異と新規遺伝的変異が明らかになりました。 科学。 議員第 5 号、9124 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

ストリンガー、RN 他筋萎縮性側索硬化症に関連するまれな CACNA1H 変異体は、Cav3.2 T 型チャネル活性の完全な喪失を引き起こします。 モル。 ブレイン 13、33 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カプラン、MM et al. カルシウムの流入と放出は、神経筋接合部形成中のAChRパターン形成と運動軸索伸長を協調的に制御します。 Cell Rep. 23、3891–3904 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Perez-Reyes、E. 低電圧活性化 T 型カルシウム チャネルの分子生理学。 生理。 改訂 83、117–161 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Nussbacher, JK、Tabet, R.、Yeo, GW & Lagier-Tourenne, C. 神経疾患における RNA 代謝の破壊と新たな治療介入。 ニューロン 102、294–320 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weiss, N. & Zamponi, GW 遺伝性 T 型カルシウムチャネル症。 J.Med. ジュネット。 57、1–10 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wallace, BG Ca2+ とホルボールエステルによるアグリン誘導性アセチルコリン受容体凝集の調節。 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． 107、267–278 (1988)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Megeath、LJ および Fallon、JR 細胞内カルシウムは、アグリン誘発性アセチルコリン受容体のクラスター化を調節します。 J. Neurosci. 18、672–678 (1998)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Buckingham, M. 脊椎動物における骨格筋の形成。 カー。 意見。 ジュネット。 開発者 11、440–448 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Bijlenga, P. et al. T 型 α1H Ca2+ チャネルは、ヒト筋芽細胞の最終分化 (融合) 中の Ca2+ シグナル伝達に関与します。 手順国立アカド。 科学。 米国 97、7627–7632 (2000)。

論文 CAS PubMed PubMed Central ADS Google Scholar

Schiaffino, S. & Reggiani, C. 哺乳類の骨格筋の線維の種類。 生理。 改訂 91、1447–1531 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

小野 K. & 飯島 T. 心臓の心臓の T 型 Ca2+ チャネル。 Ｊ．Ｍｏｌ． 細胞。 カーディオール。 48、65–70 (2010)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kumar、M.ら。 ELM - 2020 年の真核生物の線形モチーフ リソース。Nucleic Acids Res. 48、D296–D306 (2020)。

CAS PubMed Google Scholar

Wang, S. & Cortes, CJ PDZ タンパク質との相互作用は、電位依存性カルシウム チャネルのシグナル伝達を多様化します。 J. Neurosci. 解像度 99、332–348 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ブレンマン、J.E. et al. PDZドメインを介した一酸化窒素シンターゼとシナプス後密度タンパク質PSD-95およびα1-シントロフィンとの相互作用。 セル 84、757–767 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Adams, ME、Anderson, KN & Froehner, SC α-シントロフィンのPHおよびPDZドメインは、神経筋接合部でアセチルコリン受容体、ユートロフィン、および神経の一酸化窒素シンターゼの足場を築いています。 J. Neurosci. 30、11004–11010 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Strochlic、L.ら。 MAGI-1c: 脊椎動物の神経筋接合部で muSK と相互作用するシナプス MAGUK。 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． 153、1127–1132 (2001)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lu、Z.ら。 神経筋接合部におけるシナプス関連 E3 ユビキチンリガーゼによるシナプスの成長と成熟の制御。 Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． 177、1077–1089 (2007)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mulatz, KJ A PDZ-3 は、Cav3.2 T 型カルシウム チャネルと神経の一酸化窒素合成酵素間の物理的および機能的相互作用を媒介します。 博士論文。 (英国大学、2013)。

Grozdanovic, Z.、Christova, T. & Gossrau, R. シナプス後一酸化窒素シンターゼ I とアセチルコリンエステラーゼの局在の違いは、ラットとマウスの骨格筋における神経筋接合部の不均一性を示唆しています。 アクタヒストケム。 99、47–53 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Finanger Hedderick、EL 他筋鞘 nNOS の喪失は、後天性および遺伝性の神経筋疾患でよく見られます。 神経学 76、960–967 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

タラバル、O.ら。 脊髄性筋萎縮症のマウスモデルにおける脊髄中枢シナプス喪失に関与するメカニズム。 Ｊ．ニューロパトール。 経験値ニューロール。 73、519–535 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Clementi, E. Ca2+ 恒常性の制御における一酸化窒素とその細胞内シグナル伝達経路の役割。 生化学。 薬理学。 55、713–718 (1998)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

シェン、C.ら。 運動ニューロン Wnt は神経筋接合部の発達を調節します。 Elife 7、e34625 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Xx Motyl、AAL et al. 脊髄性筋萎縮症における全身性の発達異常の出生前症状。 ハム。 モル。 ジュネット。 29、2674–2683 (2020)。

記事 Google Scholar

オラソ、R.ら。 SMNが欠損したマウス組織ではRNA代謝関連遺伝子が活性化されるが、ヒト組織では活性化されない。 生理。 ゲノミクス 24、97–104 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ミリノ、C.ら。 重度および軽度の脊髄性筋萎縮症の影響を受ける筋肉における異なる萎縮-肥大転写経路。 BMC医学。 7、14 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Hsieh-Li、HM 他脊髄性筋萎縮症のマウスモデル。 ナット。 ジュネット。 24、66–70 (2000)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Renvoisé, B.、Quérol, G.、Verrier, ER、Burlet, P. & Lefebvre, S. SMN 複合体形成およびカハール小体への核内局在におけるプロテイン ホスファターゼ PP1γ の役割。 J. Cell Sci. 125、2862–2874 (2012)。

PubMed Google Scholar

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BioMedTech Facilities INSERM US36 |の中核施設に感謝します。 CNRS UMS2009 | 動物実験、分子生物学、顕微鏡の支援のためのパリ大学。 絶え間ないサポートをしていただいた R Barouki 氏、J Cartaud 氏、F Charbonnier 氏に感謝いたします。 奨学金インターンシップ中に技術的な支援をしていただいた M Nabi 氏と PE Fontaine 氏に感謝します。 原稿を批判的に読み、プロトコールと試薬を寛大に提供してくださった同僚に感謝します。

この研究は、国立サンテ・医学研究院（INSERM、施設およびSLへの給与）、国立科学研究センター（CNRS、施設）およびパリ・シテ大学（PD、BSおよびDSへの施設および給与）によって支援されました。 ）。 SL への補助金 CONV-16-SMA-Lefebvre および ANR-21-CE17-0039-01 は、それぞれ SMA Europe および ANR からのものです。

Perrine Delers と Delphine Sapaly の著者も同様に貢献しました。

T3S、INSERM、パリ シテ大学、75006、パリ、フランス

ペリーヌ・デレール、デルフィーヌ・サパリ、バディ・サルマン、スージー・ルフェーブル

The Thorax Institute、INSERM、CNRS、ナント大学、44000、ナント、フランス

ステファン・デ・ワールド & ミシェル・デ・ワールド

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PD、DS、BS、SDW、MDW、SL が実験を実施しました。 PD、DS、BS、SDW、MDW、SL が分析を実施しました。 SL がこのプロジェクトを発案し、原稿を書きました。 すべての著者が原稿についてコメントしました。

スージー・ルフェーブルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Delers、P.、Sapaly、D.、Salman、B. 他。 脊髄性筋萎縮症における神経筋接合部におけるアグリンシグナル伝達とCav3.2との関連。 Sci Rep 12、18960 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-23703-x

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受信日: 2022 年 1 月 20 日

受理日: 2022 年 11 月 3 日

公開日: 2022 年 11 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23703-x

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