高い

Dec 29, 2023

Nature Communications volume 13、記事番号: 7241 (2022) この記事を引用

4355 アクセス

3 引用

104 オルトメトリック

メトリクスの詳細

クレブシエラ ジャンボ ミオファージ ϕKp24 は、宿主細胞と相互作用する尾部繊維の異常に複雑な配置を示します。 この研究では、極低温電子顕微鏡法、タンパク質構造予測法、分子シミュレーション、微生物学的アプローチと機械学習アプローチを組み合わせて、ϕKp24のキャプシド、尾部、および尾部繊維を調査します。 キャプシドとテールの構造を 4.1 Å および 3.0 Å の分解能で決定します。 細胞表面に付着すると、尾部繊維が分岐し、劇的に再配置されることが観察されます。 この複雑な構成には、デポリメラーゼ活性を持つ 14 本の推定尾線維が含まれており、これにより、肺炎桿菌の広範な莢膜多糖類 (CPS) 型に感染する能力を ϕKp24 に提供します。 私たちの研究は、ϕKp24が莢膜病原菌の可変表面にどのように適応するかについての構造的および機能的洞察を提供し、これは汎薬剤耐性肺炎桿菌株に対するファージ療法アプローチの開発に役立ちます。

病気の原因となる細菌は、人間の健康に対する脅威をますます増大させています。 多くの細菌感染症は抗生物質で効果的に治療できますが、抗菌薬耐性（AMR）により効果のない治療法が増えています。 最近の研究では、2019 年に 6 つの主要な病原体で AMR に関連して 357 万人が死亡したと報告されています1。その中には、世界保健機関によって新しい抗生物質の開発の優先順位 1 (重要) として認識されている病原体である肺炎桿菌も含まれています2。 K. pneumoniae は、ヒト、特に免疫力が低下している人に、肺炎、尿路感染症、菌血症、その他の感染症を引き起こす可能性があります3。 肺炎桿菌臨床分離株の大多数は、宿主の免疫系からの保護を仲介する重要な病原性因子と一般に考えられている顕著な莢膜を発現します4。 遺伝的に異なる莢膜遺伝子座のタイプは 100 を超え、そのうち 77 のよく特徴付けられた化学構造が血清型別 (K タイプ) に使用されます。

多剤耐性肺炎桿菌は標準治療の抗生物質には感受性がありませんが、依然としてバクテリオファージ感染には影響されやすいです。 バクテリオファージ、または略してファージは、細菌に感染するウイルスです。 クレブシエラ属特異的ファージは、その自然宿主に感染して殺すことができます。 ただし、これらのファージのほとんどは、一次ファージ受容体として機能するこの種の可変莢膜多糖類 (CPS) により、通常、高度に株特異的です。 ファージΦK64-1またはvB_KleM-RaK26,7を含む莢膜依存性クレブシエラ・ファージには、ファージの吸着を成功させるCPS分解酵素ドメイン（コイン化カプセルデポリメラーゼ）を含む受容体結合タンパク質（RBP）として機能する尾部繊維または尾部スパイクが装備されています。感染症8. 簡単にするために、今後は「テールファイバー」という用語を使用します。

>200 kbp の DNA ゲノムを持つ尾部バクテリオファージはジャンボ ファージとして定義されます9。 ジャンボファージの最も注目すべき構造的特徴は、そのゲノムをカプセル化する大きなキャプシドです10。 最近報告された vB_KpM_FBKp24 (ϕKp24) ジャンボ ミオファージは、異なるデポリメラーゼ ドメインを含む少なくとも 9 本の尾部繊維をコードしており、これは宿主範囲の拡大を示唆しています。 ゲノム分析により、ϕKp24 は他の既知のファージとの類似性が非常に限られており 11、したがって Vanleeuwenhoekviridae と呼ばれる新しい科を構成することが明らかになりました (ICTV 分類中)。 さらに、透過型電子顕微鏡により、ベースプレートの尾部繊維の独特の複雑な構造が明らかになりました。 しかし、このユニークな尾繊維セットの構造と機能についてのより詳細な洞察は現在不足しています。

ϕKp24 の異常な構造についての洞察を得るために、さまざまな構造法を使用してそのキャプシド、尾部、および尾部繊維を分析しました。 我々は、AlphaFold212タンパク質の構造予測と分子動力学（MD）シミュレーションと組み合わせたクライオ電子顕微鏡（クライオEM）単粒子解析（SPA）を使用して、高度に秩序化されたファージのキャプシドと尾部の原子モデルを生成しました。 データにより、φKp24 のキャプシドの異常な特徴、最も顕著なのは単一の MCP によるキャプシド全体の組成、および六角形の中心に細孔が存在することが明らかになりました。 私たちは、クライオ電子断層撮影法 (cryo-ET) を使用して、柔軟で無秩序な尾部繊維の構造についての洞察を得ました。 この分析は、断層撮影データの定量分析のために複雑な尾部繊維を自動的に追跡するようにニューラル ネットワークをトレーニングする機械学習アプローチによって支援されました。 私たちの分析により、感染プロセス中に尾部繊維の顕著な再配置が明らかになりました。 さらに、我々は肺炎桿菌株のK血清型コレクションを使用してϕKp24の感染力をテストし、尾部繊維が標的とするCPS型の異常に幅広いパネルを示した。

アミノ酸配列の予測とクレブシエラ血清型ライブラリーに対する結合アッセイを、尾部繊維の構造機能分析と組み合わせて行うことで、それらの多分岐複合組織についての洞察が得られました。 構造技術、計算技術、実験技術を組み合わせることで、この独特のバクテリオファージの構造と機能についての深い洞察を得ることができました。

ϕKp24キャプシドの構造を研究するために、cryo-EMを使用してファージを画像化しました（補足図1a、補足表1のデータ収集パラメーター）。 私たちのデータセットでは、キャプシドの 3 つのバリアント (DNA で満たされた完全なキャプシド、空のキャプシド、部分的に DNA で満たされたキャプシド) が見つかりました。 我々は、研磨およびエワルド球補正後のRelion13をそれぞれ4.3Åおよび4.1Åの分解能で、ϕKp24の完全な（EMD-14356、補足図1b、シアン）および空の（EMD-13862、図1a）キャプシド構造を再構築しました。 「ゴールドスタンダード」FSC0.143基準14を使用します（補足図2b、c）。 空のキャプシドと完全なキャプシドの再構成はよく重なっているため（補足図1d）、空のキャプシドの高解像度再構成（4.1Å）に分析を集中させました。 空のキャプシド（図1a）は、頂点から頂点までの直径が145 nm、二重対称軸に沿って130 nmで、T = 27（h = 3; k = 3; T = h2 + k2 + hk）に従います。平面的な輪郭を持つ三角形分割の対称性。 (図1b)。

a ファージ ϕKp24 の dsDNA が空のキャプシド (EMD-13862) は、19,193 個の粒子を使用して 4.1 Å の解像度で再構築されました。 表示された構造は、右下のカラーバーを使用して、キャプシド中心からの距離に基づいて放射状に色付けされます。 b ϕKp24キャプシド組織を示す概略図。 カプシドは T = 27 の対称性に従います。 三角測量対称計算の h ボリュームと k ボリュームは赤色で強調表示されます (https://viralzone.expasy.org/8577)。 c 1 つの六量体の組織。 六量体は、アーム（青）または手（オレンジ）を介して他の六量体または五量体と相互作用することができ、これらは他のファージ構造に存在する装飾タンパク質と同様の安定化機能を有すると考えられます。 d AlphaFold2によって生成されたファージϕKp24からのgp372のリボン図。 モデルは、c の六量体のモノマーに対応して色付けされた 3 つの部分で構成されます。 右のパネルは、密度マップに当てはめられた gp372 を示しています。 e 六量体カプソメアの上面図。 6 つのモノマーは個別に着色されています。 六量体の中心には、6 つの長い C 末端ループがねじれて細孔が形成されています (拡大された長方形のボックス、右上のパネル)。 右下のパネルは、上の画像を 90 度回転した後の毛穴を示しています。 f カプソメア間相互作用が強調された 2 つの六量体。 2 つの gp372 ハンド領域は、E201、K210、K247、D249、E251、D260、および R264 を含む荷電残基の大きなクラスターを介して相互作用します (拡大された長方形のボックス、上のパネル)。 同じ六量体内の MCP 三角体は、時計回りに隣接する残基 R477 と E442、および時計回りに隣接する残基 R583 と D419 と D587 の両方の間の相補的塩橋を使用して相互作用します (拡大された長方形のボックス、左下のパネル)。 三角形の本体は、K380/E220、E398/R190、R554/E313、および R558/D163 を含む一連の塩橋を通じて手の領域とも相互作用します (拡大された長方形のボックス、右下のパネル)。 水素結合は、緩和された距離および角度基準 (それぞれ 0.4 Å および 20° 許容値) を備えた ChimeraX を使用して分析されました。 g 上の画像を 90°回転した後の六量体-六量体相互作用の側面図。

緑膿菌ジャンボ ファージ phiKZ15、および Ralstonia solanacearum ファージ ϕRSL116、および ϕRSL217 のキャプシドは、三角形分割数 T = 27 で HK97 フォールド 18,19 に構築されます。 これらのファージ キャプシドと同様に、ϕKp24 のキャプシドは次の方法で構築されます。各面の六量体と五量体の格子（図1b）。 φKp24 の六量体と五量体は、同じ主要キャプシドタンパク質 (MCP、gp372、アクセッション番号 QQV92002) のコピーで構成されています。 カプシドには、合計 260 個の六量体 (濃い緑色、ファセットごとに 13 個) と 11 個の五量体 (青緑色、1 つの頂点がポータル複合体によって占められている) が含まれており、これらは MCP の 1615 コピーを表します (補足ムービー 1)。 MCP は、ファージ ゲノムを囲む正二十面体の殻に組み立てられます。 ϕKp24の場合、予測されるMCPはgp372です（図1d、左）。

Gp372 は 597 個のアミノ酸を含み、我々の知る限り、ファージで現在報告されている最大の MCP です。 その構造は、AlphaFold212 を使用して予測およびモデル化されました (図 1d、左)。 それは 3 つの主要な部分で構成されます。「三角形本体」 (図 1c、灰色の三角形、および図 1d、点線のボックス、残基 28 ～ 88、314 ～ 597)。 「アーム」（図1c、青い楕円、および図1d、青色、残基89〜166）。 そして「手」（図1c、オレンジ色の楕円形、および図1d、オレンジ色、残基167〜313）。

MCP gp372 の三角体は、ファージ HK9720,21 の MCP gp5 と配列レベルでの類似性を示さないが、ある程度の構造的類似性を示す。 ただし、ϕKp24 と HK97 の MCP の間にはいくつかの顕著な違いがあります。 φKp24 の Gp372 には、HK97 には存在しない長い C 末端ループ (細孔の構成要素) が含まれています。 さらに、N 末端ドメインと C 末端ドメインは異なる折り方をしています: (1) HK97 gp5 モノマーの A ドメインは 4 つの中央のほとんど逆平行な β シートと 2 つのヘリックスを持っています 20。 対照的に、gp372 の対応するドメイン (C 末端ドメイン) には、5 つの逆平行βシートと異なる長さの 4 つのヘリックスが存在します。 （2）HK97 gp5モノマーのN末端アームはほとんど構造化されていない立体構造ですが、gp372のN末端は長いヘリックスとして折りたたまれています（補足図5、6）。 アームは、2 つの短い逆平行 β シート、3 つの短いヘリックス、および「手」に近い 1 つの短い β シートで構成されます。 手の最も顕著な特徴は 2 層の β シートであり、各層には 3 つの逆平行の β シートが含まれています。 さらに、「手」の先端には2つの短いらせんがあります。

3DクライオEMデータに従ってgp372構造をさらに改良し、ネイティブキャプシドアセンブリにおけるMCP間の推定相互作用を決定するために、次に、最も近い隣接する六量体を含む、キャプシド六量体および五量体アセンブリのモデルを再構築しました（補足図9）。 「方法」セクションで詳しく説明されています。 簡単に説明すると、六量体および五量体集合体のモデルは、予測された gp372 構造の剛体ドッキングによって最初に構築され、続いて分子動力学フレキシブル フィッティング (MDFF)22 を使用して 4.1 Å マップに精密化されました。 得られた六量体モデルは、精製された五量体および六量体の集合体を囲む対応する領域にしっかりとドッキングされ、結合された構造に対して追加の MDFF シミュレーションが行われました。 したがって、得られたモデルは、キャプシド内のそれぞれの固有の MCP-MCP 相互作用に関する代表的な情報を提供し、キャプシドの安定性に重要と考えられる主要な残基間相互作用の評価を可能にします。

六量体のMCP間接触を分析した後、推定上の強い相互作用のリストを作成しました（補足図9）。 MCPの三角形体は、主に、直接隣接し、同じ六量体内のMCPの三角形体と相互作用します（図1f）。 これらの相互作用には、時計回りに隣接する残基 R477 と E442、および時計回りに隣接する残基 R583 と D419 および D587 の間の一連の相補的塩橋が含まれます。 三角形の本体は、K380 / E220、E398 / R190、R554 / E313、およびR558 / D163を含む一連の塩橋（図1f）を介して、時計回りに隣接するものの手の領域とも強く相互作用します。 同じ六量体内のMCP間で形成されるこれらの相互作用に加えて、ハンド領域は、隣接する六量体からのMCPのハンド領域との強い相互作用も媒介します（図1f）。 これらには、相補的相互作用を形成する E201、K210、K247、D249、E251、D260、および R264 を含む荷電残基の大きなクラスターが含まれます。 中心と周囲の六量体の全体的な立体構造は非常に類似しており、バックボーンの二乗平均平方根変位 (RMSD) は約 1.5 Å です。 最後に、他の既知のファージキャプシド構造 23,24 と比較して、ϕKp24 の MCP は、我々の知る限りこれまでに報告されていない構造的特徴を示しました。6 つの長い C 末端ループ (残基 Q582 ～ S597) のそれぞれが、外径約2 nmの中央螺旋細孔の形成（図1e、右上および下のパネル）。 細孔に沿った静電気の分析（補足図10）は、入口付近（外側から内部キャプシドへ）が親水性であるのに対し、反対側からは親油性であることを示しています。 また、細孔中心付近にはマイナスに帯電した環状部分が存在します。

各五量体は 5 つの MCP モノマーから構成されます (図 2a)。 六量体の gp372 と比較すると、五量体の gp372 の N 末端は異なる折り畳み方向を示します (図 2b、左パネル)。 さらに、五量体の gp372 は六角形の MCP と比較して三角形の本体と手の相対的な向きを変化させ、五量体の gp372 をより湾曲させます。 (図2b、右パネル)。 五量体を囲む六量体と六量体集合体からの六量体を比較すると、それらもわずかに湾曲しており、3 ～ 5 Å の RMSD を示すことがわかります。

五量体カプソメアの上面図。 5 つの gp372 構造を密度マップに当てはめ、異なる色で表示しました。 六量体と比較して、五量体には中心に構造化された細孔がありません。 各 C 末端ループは柔軟で、別の gp372 の手に近い領域に移動する傾向があります。 b 六量体の MCP (シアン) と五量体の MCP (灰色) の構造比較。 C 末端ループ、N 末端 α ヘリックス、2 つの三角形体 (並べられた手と腕) の振り子角 (上の赤い矢印)、または 2 つの三角形の振り子角 (下の赤い矢印) など、いくつかの違いがあります。 2 本の手 (整列した三角形の体)。 b の右の画像は、左の構造を 90 度回転した後の比較を示しています。 c 五量体と六量体の相互作用。 五量体 (灰色) と隣接する六量体 (シアン) の間の相互作用は、2 つの六量体間の相互作用と似ています。 左上のパネルは、時計回り (CW) の隣の手 (灰色) が、塩橋 (残基 E220 と K380、E163、および R558) を使用して同じ五量体の三角形の本体 (紫) と相互作用できることを示しています。 五量体 MCP では、三角体の残基 R501 および R583 が残基 D448 および E442 と相互作用します (拡大された長方形のボックス、右上パネル)。 六量体由来の gp372 と五量体由来の gp372 は、構造単位に応じて異なる色で強調表示されます。 六量体の gp372 の三角形の胴体、腕、手は、黒、深い青、オレンジ色に着色されています。 五量体の gp372 の三角形の体、腕、手は、紫、緑、ピンクに色付けされています。 d 上の画像を90°回転した後の五量体-六量体相互作用の側面図。

全体として、五量体のMCP相互作用領域は六量体で見られるものと類似しています（図1f、補足図9）。 ただし、五量体の曲率の増加（図1g、2d）により、三角形の本体と手の領域の間の相対的な配向が変化し、異なる安定化接触が生じます。 具体的には、五量体 MCP では、三角形本体の残基 R501 および R583 が、時計回りに隣接する三角形本体の残基 D448 および E442 とそれぞれ相互作用します。 時計回りの手領域との相互作用は全体的に減少しており、残基 K380 および R558 がそれぞれ残基 E220 および D163 と相互作用しています。 さらに、六量体 MCP に見られるように、五量体 MCP のハンド領域は、上記の残基の荷電パッチを介して隣接する六量体との手と手の相互作用を媒介する際に同様の役割を果たします。 六量体の配置とは対照的に、五量体の C 末端ループは、密度マップで大きく明確に定義された細孔を形成しているようには見えません。 代わりに、おそらくこの領域のMCP間の減少した空間とより大きな立体障害に対するこの異なる配置のせいで、それらは無秩序になっています（図2a）。 それにもかかわらず、我々は、五量体の中心に、溶媒を輸送できる可能性のある小さな開口部を観察した。

尾部のらせん再構成のために、完全なキャプシドを含むファージから 450 ピクセルのセグメントが選択されました。 分類、研磨、および3D精製後、拡張立体構造の尾部構造（EMD-14357、図3a）がRelion13で3.0Åの解像度で決定されました（補足図11b）。 伸びた尾の長さは平均 180 nm (カラーからスパイクの先端まで、2D 顕微鏡写真で測定) です。 密度マップに基づくと、テールの直径は 24.5 nm、最長軸を横切るシース モノマーの長さは 11 nm です (図 3a)。 他の記載されている収縮性駆出システムおよびバクテリオファージ尾部と同様に、φKp24 の収縮性尾鞘は内管の周囲に組み立てられています。 シースとインナーチューブは同じ螺旋対称性に従い、尾軸の周りにさらに 6 回の対称性を持っています。 1つの六量体環の厚さは4nmです。 HI3D25 を使用すると、ヘリカルライズとツイストはそれぞれ 39.03 Å と 20.89° と決定されます。

a 3.0 Å ヘリカルテールの 3D 構造 (EMD-14357) の上面図 (上の画像) と側面図 (下の画像) の方向。 6 本のらせん状ストランドはそれぞれ異なる色になっています。 b Alphafold2 から生成された尾鞘タンパク質 gp118 のモデル。 シースタンパク質 gp118 と内管タンパク質 gp119 を、φKp24 EM マップの 1 つのリングに適合させました (上の画像、上面図、下の画像、側面図)。 下のパネルでは、環間相互作用を視覚化できるように、下層に由来するシースモノマー (青) が示されています。 3 つのシース モノマー間の接触は、2 つの連続するリングから強調表示されます (拡大された長方形のボックス、右下のパネル)。 c ϕKp24シースモノマー、gp118の予測されたAlphaFold2モデルのリボン図。 モデルは、中央のシース (点線のボックス、オレンジと濃い青) と拡張された外側のシース コンポーネント (水色) の 2 つの部分で構成されます。 下の画像は、N 末端の伸長を示すために上の画像に対して 90°回転されています。 d ϕKp24 シース組織の概略図。 2 つの層からの 3 つのシース モノマーが相互作用するリッジが円で示されています。

シースタンパク質（gp118、アクセッション番号QQV92013.1）の構造は、AlphaFold2を使用して予測され、ChimeraX27のISOLDE26を使用してφKp24テールEMマップに適合されました（図3b）。 全長シースタンパク質は、外側シース成分と中央シース成分から構成されます。 外側のシース コンポーネント (図 3c、水色) はシース モノマーの先端に位置し、外側を向いています。 ENDscript328による配列分析は、外側シース成分がバクテリオファージphiKZ由来の尾シースタンパク質gp29PR（PDB ID：3SPE）のホモログであることを示しています（補足図15）。 この外側シース成分は、組み立て中のサブユニット間の相互作用には関与しません 29。 収縮した構造では、2 つの層の外側シース構成要素が静電力を通じて相互作用する可能性があります。 これは、外側シースコンポーネントの上向きの表面には負に帯電したパッチが含まれているのに対し、下向きの表面には正に帯電したパッチが表示されているためと考えられます（補足図18）。

中央のシース成分 (図 3c、オレンジ色、および濃青色) は、C 末端ドメイン、N 末端ドメイン、および 2 つの長い伸長部から構成されます。 中央シースはシースの組み立てと収縮に不可欠です。 尾の尾鞘タンパク質間の相互作用を促進するために、中央鞘からの 2 つの長い伸長 (N 末端伸長、残基 M1 ～ S21、C 末端伸長、残基 A667 ～ G689) が C 末端に接続できます。下のリングに位置する 2 つの隣接する gp118 タンパク質のドメイン (図 3d)。 さらに、C末端ドメインは、上部リングに位置する2つの隣接するシースタンパク質と接続することができます（図3b、右下のパネル）。 したがって、2つの異なる層に由来する3つのシースタンパク質は、いわゆるリッジ内で結合します（図3d）。 中央のシース成分は、同じ層のリング内では相互作用できず、リング間のすべての相互作用はリッジに限定されます（図3a、d）。 原子構造は、シースの伸張が「メッシュ」を作成できることを示しています（図3d）。

ファージ T430、R 型ピオシン 31、セラチア エントモフィラ抗摂食プロファージ (afp) 32、細菌の VI 型分泌システム (T6SS) 33,34 などの他の収縮性注入システムのチューブは、異なる基質を移動する能力を示し、基板の性質によってチューブのチャネルの特性が決まります30。 ファージΦKp24のチューブも同様の機能を示します。

チューブタンパク質（gp119、アクセッション番号QQV92088.1、図4a）の構造は、AlphaFold2を使用して予測され、φKp24テールEMマップに柔軟にフィットしました。 gp119 を使用してファージ ϕKp24 のチューブのモデルを構築しました。 6つのチューブタンパク質からなる1つのリング状構造は、ファージΦKp24の内チューブの集合単位を表します（図4b、c）。 gp119 には 2 つの最も顕著な特徴があります。(1) 長い C 末端伸長は、真上の層 (カプシドに近い方向) に位置する別の gp119 に到達することができます。 （２）Ｎ末端ドメインは、同じディスク内の隣接するｇｐ１１９まで拡張することができる（図４ｂ）。 ファージT4のチューブタンパク質モノマーgp19（PDB：5W5F）と比較すると、gp119は配列類似性を示さないが、そのコアで同様の折り畳みを示します（gp19はより短いC末端伸長とより小さなN末端ドメインを持っています）（補足図21a） 。 gp119とgp19は共通して2層のβシートを持っています。 さらに、2 つの長い抗 β シートは、同じディスク内の隣接するチューブタンパク質まで伸びることができます。 (補足図21)。 チューブの内面は顕著な負電荷を示し (図 4d)、負に帯電したファージ DNA が表面に付着するのを防ぎます。

ϕKp24 のチューブタンパク質モノマー gp119 の予測 AlphaFold2 モデルのリボン ダイアグラム (ChimeraX で虹色)。 b ファージΦKp24のチューブ内の2つのディスク（六量体）のリボン図。典型的なgp119の1つが虹色で示されている。 c チューブ構造 (3 枚のディスク) のリボン図としての断面図。 ｄ ｃのチューブ構造の内面を示す静電図。 電荷分布: 赤 = 負。 青 = ポジティブ。 白 = ニュートラル。 ChimeraX では静電ポテンシャルを色付けしました。 e シースタンパク質の一部（中央シースのC末端ドメイン）と4つのチューブタンパク質サブユニットの間の境界面の側面図。 gp118の残基R623は、塩橋を使用してgp119の残基D268と相互作用することができる(拡大された長方形のボックス、左上のパネル)。 f e の帯電した表面。 g 本を開いた状態の図 f。 シースとチューブの両方の相互作用する電荷の相補的なパッチは楕円でマークされています。

シースとチューブの相互作用は、静電気力と非共有結合力、および尾管と周囲のシースの間のナノスケールギャップ (間質水) の粘度から生じる可能性があります 35。 静電力は尾管の軸に対してほぼ垂直であるため、シースと尾管の間の接続に寄与します。 ファージΦKp24の場合、シースは水素結合を介してインナーチューブと相互作用します。シースタンパク質gp118の残基R623は、塩橋を介してチューブタンパク質gp119の残基D268と相互作用できます（図4e）。 さらに、シースタンパク質gp118は静電相互作用を利用して内管サブユニットと結合します（図4g）。 チューブサブユニットの外表面には、正に帯電したパッチが表示されます（図4g、右パネル）。 シースタンパク質の C 末端ドメインは、2 つの α ヘリックスの 1 つにある相補的な負に荷電したパッチを介してチューブのパッチに結合します。

尾管は、ファージ尾部の伸長状態における鞘の組み立てにおいて重要な役割を果たすことが知られている 36。 他のファージテールシステムと同様に、ファージ T437 の場合と同様に、ϕKp24 の鞘の組み立てはベースプレートから始まると考えられます。 チューブとベースプレートは、シースサブユニットの最初のディスクが結合する「プラットフォーム」を形成することができます。 続いて、拡張されたシース サブユニットのチューブとディスクは、シースの残りの部分を組み立てるための足場として機能します。 したがって、収縮状態の集合は、シースサブユニットが横方向の接触なしに隆起に沿って相互作用するテンプレートの作成によって回避されます（図3d）。 このテンプレート駆動型の集合により、おそらく準安定なオリゴマー構造が形成され、標的細胞表面との相互作用時に尾部が収縮するベースプレートによってロックが解除される可能性があります。

細胞付着とゲノム注入中の尾繊維の構造と構造変化を調べるために、cryo-ET を使用しました。 われわれは、ϕKp24をその肺炎桿菌宿主とともにイメージングし、無傷のファージを4つの異なる状態で観察した。すなわち、DNAを含む遊離粒子とDNAを含まない吸着粒子、およびDNAを含む吸着粒子とDNAを含まない吸着粒子である。 これら 4 つの状態は、ファージ感染中の 4 つの異なる状態に対応します。遊離ファージ、宿主に付着した感染初期ファージ、細胞に付着したままの感染後 (空の) ファージ、および感染後 (空の) 遊離ファージです。 代表的な 2D クライオ ET 画像 (図 5a) は、これらの状態のいくつかを示しています。 感染過程のさまざまな瞬間における無秩序な線維の構造を見つけるために、我々は、肺炎桿菌細胞に結合した無傷の ϕKp24 に焦点を当てました。 IMOD38 でノイズ除去された 89 個の 3D 再構成から無傷のファージを選択して抽出しました。

ネイティブ環境におけるファージ ϕKp24 のいくつかの異なる状態を示す 2D クライオ ET 画像: 遊離ファージ (暗いキャプシドを持つファージ、青い矢印)、初期感染ファージ (暗いキャプシドを持つファージ、宿主膜に付着したファージ、黒い矢印)、中央-感染ファージ（半分暗いキャプシドを持ち、宿主膜に付着しているファージ、緑色の矢印）、および細胞に付着したままの感染後（空の）ファージ（白色の矢印）。 b ファージ ϕKp24 のトリミングされた断層像と手動セグメンテーション。 最初の列は、注入中のさまざまな状態での φKp24 の 7 つの代表的な断層像を示しています。 上から下に、最初の断層像は遊離のファージ (フルキャプシド) を示し、2 番目から 4 番目の断層像は細胞に結合した感染初期のファージ (完全なキャプシド) を示し、5 番目から 7 番目の断層像は感染後のファージ (空) を示しています。 capsid) がホストに接続されます。 2 番目の列は、左側に示した断層像に対応する尾部繊維の 7 つの手動セグメンテーションを示しています。 シースは紫色、ファイバーはシアン色、チューブは黄色に着色されています。 3 番目の列は、90 度回転した後のすべての左セグメンテーションの側面図を示しています。

尾部繊維の複雑さと不均一な性質のため、IMOD セグメンテーション機能 38 を使用して尾部繊維を手動でセグメント化することを選択しました。 まず、断層像全体から個々のファージのサブボリュームを抽出しました（図5b）。 ここでは、感染前から感染後まで、感染のさまざまな段階にあるファージを選択することを目的としました。 次に、これらのファージのファージテールをセグメント化し（図5b）、それらの全体的な構造を比較しました。 我々は、感染前のファージの繊維が、ほぼ球形の組織でベースプレートの周囲に配置されていることを発見した。 対照的に、ファージが宿主細胞に付着すると、繊維が細胞エンベロープ上の結合部位と相互作用し、全体の構造が変化します。 尾部繊維は細胞表面に沿って配置され、平らな「尾板」を形成します。 さらに、付着したファージの尾部が細胞エンベロープに対して垂直に配置されていないことが観察されます。 代わりに、傾いています。これはサンプル調製のアーチファクトである可能性がありますが、場合によってはゲノムの注入が斜めに行われる可能性もあります。

尾部繊維の手動セグメンテーションには時間がかかるため、再構成された断層像でファージ ϕKp24 の尾部繊維を自動検出するニューラル ネットワーク 39 を構築しました。 尾部繊維の手動セグメンテーションを使用してネットワークをトレーニングし、数回の最適化を行った後、トレーニングされたネットワークをすべての断層像に適用して、尾部繊維構造を含む 3D マップを生成しました。 感染前ファージを次のように定義します: (1) カプシドが充実している、(2) 尾部が伸びている、(3) ファージが無傷である、および (4) ファージが細菌細胞と接触していない。 同様に、感染後のファージを次のように定義します: (1) キャプシドは空、(2) 尾部は収縮、(3) ファイバーの先端と細胞膜の間にいくつかの接続があります。 抽出とフォーマット変換の後、感染前のファージの 89 個の尾部繊維構造と、感染後に付着したファージの 338 個の尾部繊維構造が生成されました。 感染前の尾部繊維構造と感染後の尾部繊維構造の40個の代表的なものを目視検査によって選択し、補足図に示します。 これらの 3D 構造は、各尾部繊維構造が異なる立体構造であることを明確に示しています。 感染前のファージグループ（補足図24）では、尾部繊維はベースプレートの周りに球形に近い配置で配置されています。 尾部ファイバー構造のサイズ範囲は、高さ約 110 ～ 130 nm、長さ 150 ～ 170 nm、厚さ 90 ～ 130 nm です。 注射後のファージグループ（補足図25）では、尾部繊維構造の大部分が楕円形のディスク状の構成で配置されています。 3D のサイズ範囲は、高さ 120 ～ 150 nm、長さ 160 ～ 190 nm、厚さ 60 ～ 100 nm です。

感染前および感染後の段階における尾部繊維の構造変化をさらに明らかにするために、各グループ内のマップを互いに位置合わせし、平均して「標準的な」繊維形状を作成しました。 最後に、感染前（図6a）と感染後（図6b）の尾繊維の3D重ね合わせ構造が得られました。これは、球形に近い形状から平らな円盤への尾繊維の構造変化を明確に示しています。 これらの構成の間では、厚さは約 40 nm 変化します。 さらに、感染後の重ね合わせ構造の尾部は繊維のディスクに対して垂直ではなく、これは、DNA 注入中に尾部が宿主表面に対して垂直に配向されていないことを示唆しています。 これは、尾部繊維の個々の構造や手動セグメンテーションでも明らかです。 ファージ ϕKp24 の付着、尾部繊維の再構成、DNA の排出を示すアニメーションを作成しました (補足ムービー 2)。

感染前のファージの尾部繊維の 3D 重ね合わせ構造。 感染前ファージの 89 個の尾部繊維構造を整列させて平均化しました。 右の図は、90°回転後の構造の側面図を示しています。 外枠と赤線はともにピクセル単位のスケールバーです。 外側の正方形のボックスのサイズは 200 ピクセル、ピクセル サイズは 1.312 nm です。 テールファイバー構造のサイズは、長さ約 137.8 nm、高さ 78.7 nm、厚さ 104.9 nm です。 b 感染後のファージの尾部繊維の 3D 重ね合わせ構造。 宿主に付着した感染後のファージの 338 個の尾部繊維構造を整列させて平均化しました。 尾部繊維の構造は平らな円盤に似ています。 サイズは長さ177.1nm、高さ118.1nm、厚さ65.6nmです。 c ファージの鞘（紫）、内管（黄色）、尾部繊維の構造（シアン）の模式図。 ここでは、構造の高さ、長さ、厚さを定義しました。

77 の異なる莢膜 (K 型) 血清型を持つ株のコレクションを使用して、φKp24 の感染力を特徴付けました。 この分析により、9 つの血清型の代表的な株 (K2、K13、K19、K25、K35、K46、K61、K64、および K81) が ϕKp24 宿主株と比較して 1-0.001 の範囲のプレーティング効率で ϕKp24 に感受性であることが明らかになりました (補足図)。 26および補足データ1)。 しかし、配列類似性 40 および構造ベースの相同性モデリング 41 は、ファージが 14 個の尾部繊維タンパク質 (gp168、gp196、gp294、gp295、gp300、gp301、gp303、gp304、gp306、gp307、gp308、gp309、gp310、および gp313) を保有していることを示唆しています。表 1) 以前に予測された 9 つの代わりに 11。 これらのタンパク質は、推定上の解重合活性 (リアーゼまたはヒドロラーゼ) と、クレブシエラ ファージ デポリメラーゼの特徴である β ヘリックス構造を持っています。 それらのうちの 5 つについては、実験的に検証されたデポリメラーゼとのアミノ酸配列の類似性に基づいて推定 K 血清型を予測できます (表 1)。 RoseTTAFold42を使用した14のタンパク質のモデリングにより、長軸に直交する平行なβ鎖で構成される典型的な細長い突出形状が明らかになりました（図7、補足データ2）。

a 14 の予測尾繊維のさまざまなモジュールを概略的に示すと、構造モジュールの長さに応じて 4 つのグループ (G1、G2、G3、および G4) が得られます。 予測された構造内の個々のドメインの相対的な方向は、図示されているものと異なる場合があることに注意してください。 b 14 の予測された尾部繊維構造。 デポリメラーゼ活性を持つ尾部繊維は通常、尾部の結合と分岐を担う構造モジュール (青)、分離する α ヘリックス (緑)、および酵素活性を持つ β ヘリックス (黄色) で構成されます。 c ϕKp24の尾部繊維の超分岐モデル。

Menlow グループ 8 (KpS110 および 0507-KN2-1) およびファージ ΦK64-1 グループ 6 (ΦK64-1 および RaK2) のファージは、これまでに記載された最も精巧な尾線維装置を備えたクレブシエラ ファージであり、5 本から 11 本の尾線維で構成されています。 。 クレブシエラのファージ尾部繊維の N 末端 (図 7、青色要素) は通常、ファージ尾部または別の尾部繊維への付着、または他の尾部繊維のドッキング サイトの提供に関与する構造的役割を持っています 8。 C末端（図7、黄色の要素）には、カプセル血清型の特異性を定義する酵素的デポリメラーゼドメインが含まれており、βヘリックスの折り畳みを特徴としています。 C 末端には、追加のシャペロンまたは炭水化物結合ドメインも含まれる可能性があります 43、44、45、46、47。 N 末端と C 末端は通常、α-ヘリックス 48 によって分離されています (図 7、緑色の要素)。 φKp24 の 14 の推定デポリメラーゼは、N 末端構造部分の長さに基づいて 4 つのグループ (G1 ～ G4) に分類されました。 gp306 の最も長い N 末端部分は、gp306 (G1) が主要な尾部繊維であることを示しています。 私たちのモデル（図7c）では、その大きなN末端構造ドメインが完全な超分岐尾繊維システムをベースプレートに付着させ、特定のT4gp10様ドメインを介した二次尾繊維（分岐システム）のドッキングサイトとして機能します。 これらのドメインは、ファージ G7C49 および CBA12050 の分岐尾繊維系で実験的に確認されています。 二次尾部繊維は、メンローグループファージに属するファージについて記載されているように、三次尾部繊維との追加のドッキング部位を含むことができる8。 したがって、4 つの異なるグループは、テールファイバー配置のより周辺の位置に対応します。 HHPred51 分析 (補足データ 2) では、gp306 (G1) および gp301 (G2) において、複数の尾部繊維のドッキング部位を含む長い T4gp10 様フォールドの存在が検出されました。 グループ 3 (G3) には、N 末端構造が短いものの、ドッキング部位への結合に関与するドメインを保持するには十分な 9 つのタンパク質 (gp168、gp196、gp300、gp303、gp304、gp307、gp308、gp309、および gp310) が含まれています。 デポリメラーゼ活性が予測される尾部繊維の 1 つだけが、分離する α ヘリックスの前に短い N 末端ペプチド (51 aa)、すなわち gp313 (G4) を持っています。 このペプチドは、別の尾部繊維への結合を仲介する可能性があります。 全体として、ϕKp24 の尾部繊維構造は、gp306 が主要な尾部繊維として機能する超分岐周辺層で組織化されているように見えます。

細菌性病原体における抗生物質耐性の問題が増大することにより、抗生物質耐性細菌感染症を治療するためのファージの使用に対する新たな関心が生じた。 治療用途でファージを最適に使用するには、その構造と機能についての理解を深める必要があります。 最近記載されたクレブシエラ ファージ ϕKp24 は、宿主範囲が拡大された有望な候補ファージであり、少なくとも 9 種類の莢膜に感染し、デポリメラーゼ活性を持つと予測される 14 種類の尾線維に基づくとさらに多くの種類に感染する可能性があります。

独特の形態を解明することは、詳細な構造研究にとっての課題です。 特に、カプシドのサイズが大きいことと尾部繊維の不均一な性質が、データ収集と分析に課題をもたらしています。 全体の構造を解決するには、さまざまな構造手法を組み合わせる必要があります。 AlphaFold2 や RoseTTAFold などのタンパク質構造予測アルゴリズムは、クライオ EM ベースの高分子構造解明にとって貴重なツールとなっています。 さらに、機械学習は、クライオ ET の複雑な画像データを分析する新しい方法を提供します。 この研究では、単一粒子分析とクライオ電子トモグラフィーをタンパク質構造予測、分子シミュレーション、機械学習と組み合わせました。 これにより、ΦKp24 粒子の構造と、ファージが宿主感染中に受ける特徴的な形態学的変化を明らかにすることができました。

特にカプシドのサイズが大きいことと、大量のデータも、データ処理中に計算上の課題を引き起こします。 より具体的には、ϕKp24のキャプシドの直径は約1450Åです。 Relion の FSC 曲線の勾配の低下に従って、最終的な 3D リファインメントに使用されるデータセットは、最終解像度と利用可能な計算リソースのバランスをとるために 1.5 倍でビニングする必要がありました。 空のキャプシドは 4.1 Å の解像度で再構築されました。これは、ピクセル サイズ (2.055 Å) により粒子に期待できる最高の解像度です。 ϕKp24 の空のキャプシドは、現在、EMDB (電子顕微鏡データ バンク) に登録されているジャンボ ファージの中で最も高い解像度のキャプシドです。

キャプシドの主な構造成分は MCP gp372 です。 この異常に大きいタンパク質は、キャプシドを形成する六量体と五量体の基礎となります。 通常、ファージキャプシドは、1 つ (または 2 つ) の MCP と装飾タンパク質 (MCP を結合する追加の外部タンパク質) で構成されます。 我々のϕKp24のキャプシドの再構築により、ϕKp24のキャプシド全体が単一のMCPだけで組み立てられることが示された。

六量体では、6 つの長い C 末端ループが六量体の中心に細孔を形成します。 私たちの知る限り、同様の細孔は他のファージキャプシドでこれまでに報告されていません。 この孔の正確な機能は現時点では不明です。 しかし、HIV-1 などのウイルスでは細孔が報告されています。 このビリオンは、動的キャプシド細孔を使用してヌクレオチドを取り込み、カプセル化された DNA 合成を促進します 52。 我々は、φKp24の細孔が、キャプシドへのDNAのローディング中、またはキャプシドのサイズが増加するときのDNAの排出中の圧力差のバランスに関与している可能性があると推測している。

いくつかのファージテールタンパク質とグラム陰性細菌の VI 型分泌系 (T6SS) の間には進化的な関連性が明らかになり、さまざまな病原性関連プロセスに関与しています 53,54,55。 今回報告された収縮鞘の構造は、R 型ピオシン 31 や T430 などの他の収縮系との強い類似性を示しています。 これは、ファージΦKp24のらせん尾部が同様の様式で機能することを示唆している。 さらに、今回解明された構造は、シースタンパク質 gp118 のサブユニット接続伸長 (C 末端伸長) が収縮中にヒンジとして機能し、gp118 の中央シースがその構造を維持している可能性が高いことを示唆しています。 収縮時のシースサブユニットの再配置により、より高密度に充填された構造が得られます。 ここでは、尾根が互いに接近して、部分的にかみ合うようになります。 収縮した尾部では、内側のチューブとの接続が失われ、感染中にチューブが標的細胞膜に挿入できるようになります 31。

断層像では、付着したファージの尾部が細胞エンベロープに対して垂直に見えないことが明らかになりました。 代わりに、完全なキャプシドまたは空のキャプシドを持つファージの尾部は傾いています。 この観察がサンプル調製によるアーチファクトである可能性は排除できませんが、この付着は生理学的に関連している可能性があります。 尾部を傾けると、収縮と DNA 排出に必要なエネルギーが減少し、宿主の早期溶解を防ぐために細胞エンベロープへの損傷が軽減される可能性があります。

カプシドや尾部とは異なり、尾部繊維は構造的に非常に不均一であり、単一粒子分析には適していません。 限られた数の例で正確にトレーニングできるように特別に設計されたニューラル ネットワークを使用することにより 56、わずか 7 つのファージ粒子の尾部繊維のセグメンテーションを使用してネットワークをトレーニングすることができ、それによって労力のかかる手動セグメンテーションを制限することができました。 トレーニング後、600 を超えるファージの尾部繊維のネットワークによる自動分析が可能になり、複雑な構造の分析を支援する機械学習の可能性が実証されました。

尾部繊維のデータにより、これらの尾部繊維の絶妙な複雑さと、遊離ファージと宿主細胞に結合したファージとの間のそれらの配置の重大な変化が明らかになった。 繊維は遊離ファージの尾端の周りに球として配置されますが、宿主結合ファージでは尾繊維が宿主エンベロープに適応してプレートを形成します。 注目すべきことに、尾部繊維の立体構造の変化はDNAの放出に先立って起こる。 したがって、それはトリガーメカニズム自体の一部である可能性があります。

ϕKp24 の宿主範囲分析により、このファージが標的とする前例のない数の莢膜血清型が明らかになりました。 この観察は、大きなファージゲノムで予測される特異的なデポリメラーゼ活性を有する複数の尾線維および視覚化できた高度に分岐した尾線維系に対応する。 尾線維の構造解析により、ファージ粒子内のすべての尾線維を統合する広範な構造構造が示されており、ファージ尾線と直接接触する主要な尾線維候補として浮上しているgp306が存在する一方、後続の尾線維群の構造ドメインはますます短縮されている、より周辺の場所を示唆しています。

要約すると、この多様な方法の新しい組み合わせから得られた洞察は、潜在的な臨床応用の開発に不可欠な基盤を提供します。 最近、ファージ療法が、万能薬剤耐性肺炎桿菌株によって引き起こされる感染症の治療に適用されることに成功しました13。 ここで決定されたφKp24の宿主範囲の広さは、それをファージ療法開発の魅力的な候補にする可能性がある。

この研究で使用した肺炎桿菌参照株（補足データ 1）は、パスツール研究所から入手したもの（CIP、パリ、フランス、CIP ラベル株）、または国立型培養コレクション（NCTC ラベル株）から購入したものです。 。 細菌は、20% グリセロールを添加した Trypticase Soy Broth (TSB、Becton Dickinson and Company、Cockeysville、MD、USA) 中で -70 °C で保存されました。

ファージ ϕKp24 (Genbank アクセッション番号 MW394391) は、以前に下水から単離されていました 11。 φKp24を、宿主として肺炎桿菌株K5962を用いて2Lの溶原性ブロス(LB)中で培養した(Genbank Bioprojectアクセッション番号PRJNA745534)。 得られた培養物を遠心分離し（9000×g、15分間）、ファージを含む上清を濾過滅菌した。 次いで、ファージ溶解物をSM緩衝液(100mM NaCl、8mM MgSO4、50mM Tris-HCl pH 7.5)で洗浄し、タンジェンシャルフローカセット(100kDa PES Vivaflow 200、ザルトリウス、ドイツ)を使用して10倍濃縮した。 ファージ力価は、ファージ検出用のK5962株の二層寒天プレート上にファージ溶液の段階希釈物をスポットすることによって決定した。

スポット法を使用して、血清型特異性およびファージΦKp24による莢膜ターゲティングデポリメラーゼの潜在的な産生を決定した。 分析は、肺炎桿菌血清型コレクションに対して実行されました (補足データ 1、2)。 一晩細菌培養物を新鮮なTSBに懸濁し、撹拌（140 rpm）しながら37℃で2時間インキュベートし、トリプチケース大豆寒天培地（TSA、Becton Dickinson and Company、Cockeysville、MD、USA）プレート上に注いだ。 乾燥後、ファージ φKp24 の 10 倍段階希釈液 10 μL (開始濃度として 109 PFU/mL) を細菌叢上にスポットしました。 37℃で一晩インキュベートした後、芝生のプラークゾーンとハローゾーンを検査しました。 プレーティングの効率は、試験株上の最終希釈におけるファージの力価を、その宿主株上の同じファージの力価で割ることによって計算した。

ファージφKp24のゲノム配列はGenBankデータベースから得た(NCBIアクセッション番号MW394391)。 ファージΦKp24のすべてのタンパク質を、デポリメラーゼ活性を有する推定尾部繊維を探索するためにPhyre241を用いて分析した。 推定上のデポリメラーゼ活性の予測基準は、いくつかの変更を加えたものでした。(1) タンパク質は 200 残基より長い。 (2) このタンパク質は、NCBI データベースで尾部/尾部繊維/尾部スパイク/仮説タンパク質として注釈が付けられます。 (3) このタンパク質は、リアーゼ [ヒアルロン酸リアーゼ (ヒアルロニダーゼ)、ペクチン/ペクチン酸リアーゼ、アルギン酸リアーゼ、K5 リアーゼ] または加水分解酵素 (シアリダーゼ、ラムノシダーゼ、レバナーゼ、デキストラナーゼ、キシラナーゼ、グルコシダーゼ、ガラクツロナーゼ、ガラクツロノシダーゼ、グルカナーゼ) として注釈が付けられたドメインと相同性を示します。 ) Phyre2 の信頼度は少なくとも 40%。 (4) これらの酵素ドメインの 1 つとの相同性の長さは、少なくとも 100 残基にわたる必要があります。 (5) 典型的な β ヘリックス構造は Phyre2 によって予測されるはずです。 予測されたタンパク質は RoseTTAFold42 を使用してモデル化されました。 予測されたモデルはさらに分析され、β ヘリックス構造の前の最後の α ヘリックスが N 末端構造部分の終点として選択されました。 タンパク質は、N末端構造部分の長さによって、最も長いものから順にランク付けされました。 タンパク質は、BlastP40 および HMMER57 を使用してさらに分析されました。 BlastP は、データベースで見つかったデポリメラーゼのアミノ酸配列の類似性に基づいて血清型の特異性を決定するために使用されました。 以下の基準が分析のために決定された：（i）相同タンパク質は、特定の肺炎桿菌血清型に対して確認されたデポリメラーゼ活性および特異性を有するべきである、（ii）アミノ酸配列の同一性は30％を超えるべきである、および（iii）長さは以下のとおりである。相同性は 100 アミノ酸を超える必要があります。 選択した各タンパク質の N 末端を、T4gp10 様ドメインを検索するペアワイズ アラインメントを使用して HHPred51、58 で分析しました。 デフォルトのパラメータが使用されました: MSA 生成メソッド: HHblits = >UniRef30; MSA 生成の反復数: 3; MSA 生成の E 値カットオフ: 1e-3; クエリによる MSA ヒットの最小配列同一性 (%): 0; MSA ヒットの最小カバレッジ (%): 20; 二次構造スコアリング: while_alignment; アラインメントモード:MAC と再調整: local:norealign; MAC 再調整しきい値: 0.3; ターゲットの最大ヒット数: 250; ヒットリストの最小確率 (%): 20。アライメントは、T4gp10 (NP_049768.1)、CBA120gp163 (orf 211、YP_004957865.1)、CBA120gp165 (orf 213、YP_004957867.1) および G7Cgp66 (YP) の N 末端に対して実行されました。 _004782196 .1）。

K. pneumoniae K5962を、180 rpmで振盪しながら30℃で一晩増殖させた。 一晩培養したものを 10 mL の新鮮な LB 培地に接種し、30 °C、180 rpm で 2 時間増殖させました。 続いて、1.6 mL のファージ φKp24 (9 × 1012 PFU/mL) を培養物に添加し、さらに 80 分間インキュベートしました。 培養物を視覚的にチェックして細胞溶解を確認し、200μlを遠心分離し(5000×g、5分間)、ペレットを同量の新鮮な培地に再懸濁した。 最後に、5μlの10nmサイズの金ビーズ(Cell Microscopy Core、ユトレヒト大学、ユトレヒト、オランダ)を、調製した細菌-ファージ混合物50μlに添加した。 Leica EM GP (Leica Microsystems、Wetzlar、ドイツ) を使用して、3.8 μl の混合物をグロー放電 Quantifoil R2/2、200 メッシュ Cu グリッド (Quantifoil Micro Tools GmbH、イエナ、ドイツ) に塗布し、ブロッティング前に 30 秒インキュベートしました。 20 °C、相対湿度約 95% の場合。 細菌ファージ グリッドを 1 秒間ブロッティングし、自動的に液体エタンに浸しました。 ガラス化サンプルは保管ボックスに移され、使用するまで液体窒素中で保管されました。

φKp24 は次のように濃縮しました。 1000 µl のファージ φKp24 液体 (9 × 1012 PFU/mL) を、タンパク質濃縮装置からの緩衝液の溶出が停止するまで、低速 (5 k) で 2 ～ 3 回 (15 分/スピンあたり) スピンダウンしました。 (10 kDa セルロースフィルター)。 その後、サンプルを直ちにプランジ凍結に使用しました。 Leica EM GP を使用して、濃縮ファージ 3.5 μl をグロー放電 Quantifoil R2/2、200 メッシュ Cu グリッドに添加し、18 °C、相対湿度約 95% で 10 秒間インキュベートしました。 ファージグリッドを0.7秒間ブロットし、自動的に液体エタンに浸しました。 ガラス化サンプルは使用するまで液体窒素中で保管した。

肺炎桿菌 K5962 および ϕKp24 を含むグリッドを切り取って、K3 BioQuantum 直接電子検出器とエネルギー フィルター (Gatan, Inc) を備えた Titan Krios (Thermo Fisher Scientific (TFS)) にロードし、ゼロ損失イメージングに設定しました。スリット幅は20eVです。 イメージングターゲットは、EM グリッドのカーボンフィルムの穴に存在する細菌細胞を選択することによって選択されました。 低倍率で密度が低く見える細菌は、ファージ感染が進行していることを示しています。 データは、-54° から 54° の間で 2° の傾斜増分を伴う線量対称傾斜スキームに設定された SerialEM を使用して、ムービー フレーム スタックとして収集されました 59,60。 選択された公称倍率は 26,000 で、これは収集された画像の 3.28 Å のピクセル サイズに相当します。 収集されたデータの焦点ぼけは、-4 ～ -6 μm の範囲でした。 傾斜シリーズごとの推定総線量は 100 e/Å2 でした。

φKp24含有グリッドを切り取って、Gatan K3 BioQuantum直接電子検出器（Gatan）を備えた300 kVで動作するTitan Krios電子顕微鏡（Thermo Fisher Scientific、TFS）に装填した。 映画は、EPU (Thermo Fisher Scientific、TFS) と AFIS (無収差イメージ シフト) を使用して、公称倍率 64,000 の超解像モードで記録されました。これは、デフォーカス範囲 -1 ～ -5 の 0.685 Å の校正済みピクセル サイズに相当します。 μm、総線量 30 e/Å2 (補足表 1 のデータ収集パラメーターを参照)。

動き補正、フレームアライメント、金基準を使用した傾斜シリーズアライメント、および断層像再構成は、IMOD38 を使用して実行されました。 データセットは 2 の係数でビニングされました。再構成された断層像から、はっきりと見えるベースプレートと尾線維を持つ ϕKp24 ファージが、IMOD を使用したセグメンテーションのために選択されました。 データの視覚化は IMOD と Fiji61 によって実行されました。

ファージΦKp24のキャプシドは、Relion 3.1.213を使用して再構築されました。 MotionCorr62 は、ビームによる粒子の動きを補正するために使用されました。 コントラスト伝達関数は CTFFIND 4.1.1863 によって推定されました。 最初に、自動選択用の参照テンプレートを生成するために、2D 分類用に 61 個のカプシド粒子が手動で選択されました。 次に、Relion 自動ピッキングを使用して 290,280 個の粒子を自動的に選択し、抽出中に 2D 分類のために 4 つずつビンに分けられました。 複数回の 2D 分類の後、偽陽性や汚染の特徴を持つ粒子が破棄され、28,090 個の粒子データセットが得られ、空のキャプシドと完全なキャプシドの 2 つのクラスに分類されました。 最終的な解像度と計算速度のバランスを取るために、データセットは最終ピクセル サイズ 2.055 Å、パーティクル ボックス 800 ピクセル、円形マスク直径 1600 Å で 1.5 倍にダウンサンプリングされました。 次に、抽出された粒子に対して 3D 初期モデルと分類が行われました。 粒子数が最も多いクラスが最終的な 3D 精製に使用されました (これにより、部分的に DNA で満たされたキャプシドが分離および除去されます)。 最後に、I1 正二十面体対称性を使用して 3D リファインメント用に空のキャプシド クラスとフルキャプシド クラスの両方を個別に選択し、3D リファインメント後に単側波帯画像処理アルゴリズム 64 を使用したエワルド球補正を適用しました。 最終的な再構成は、Relion 後処理によって鮮明化され、局所的にフィルター処理されました (3D 再構成のワークフロー、補足図 2a)。 マップ解像度は、ソフトエッジ溶媒マスクを掛けた 2 つの独立して調整されたハーフマップ間で計算された位相ランダム化補正された FSC 曲線の 0.143 基準で推定されました。 マップは UCSF ChimeraX27 を使用して表示されました。

ヘリカル再構成は RELION 3.1.213 を使用して実行されました。 フルキャプシドに接続された ϕKp24 テールを手動で採取しました。 手動で選択された合計 4707 のセグメントが 450 ピクセルのボックスで抽出され、2D 分類されました。 初期ねじれ値は、生の顕微鏡写真および 2D クラス平均で観察されたクロスオーバー距離から近似されました。 明確な境界を持つクラスの最も高い割合が、最終的な自動選択のテンプレートとして使用されました。 ヘリカル自動ピッキングのパラメーターは、741 枚の顕微鏡写真のサブセットで最適化されました。 データセット全体から自動選択した後、114,132 個の粒子が抽出され、2 ごとにビン分けされました。複数回の 2D 分類を実行して、偽陽性粒子と汚染特徴を除去しました。 残りの粒子は、最初の 3D モデルとして特徴のない円柱を使用して、数回の 3D 分類を受けました。 三次元精製を行った後、粒子を 4 つのクラスに分類する 3D 分類を実行しました。 最大数のクラス内の粒子が選択され、ビニングされていないデータを使用して再抽出され、C6 対称で 3D 洗練されました。 最終的な 3D リファインメントのヘリカル ライズとツイスト パラメーターは、Jiang 研究所の HI3D25 を使用して分析されました (補足表 1)。ヘリカル ライズとツイストはそれぞれ 39.03 Å と 20.89° で決定されました。 最終的な再構成は、Relion 後処理を使用して鮮明化され、局所的にフィルター処理されました (ヘリカル再構成ワークフロー、補足図 11)。 ローカル解像度は ResMap65 で生成されました (補足図 12)。

ϕKp24 タンパク質の 3D 構造は、ColabFold66 ノートブック (https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb) 経由で Alphafold v2.0 を使用して推定されました。 キャプシドの六量体および五量体アセンブリの初期モデルは、ChimeraX を使用して、AlphaFold2 で予測された gp372 モデルをキャプシドのクライオ EM マップの対応する領域に厳密にドッキングすることによって構築されました。 次に、組み立てられたモデルは、カスケード MDFF プロトコル 67 を使用して個別に洗練されました。このプロトコルは、一連の MDFF シミュレーションを実行して、解像度を増加させた一連のガウス平滑化マップを作成し、実験マップで終了します。 各モノマーの主鎖原子に対称制約を適用して、合計 5 × 1 ns の MDFF シミュレーションを各アセンブリに対して実行しました。 次に、得られた六量体モデルを六量体および五量体集合体の周囲の密度にドッキングして拡張キャプシド モデルを生成し、それぞれに追加の 5 ns MDFF シミュレーションを適用しました。 すべてのシミュレーションは、NAMD v2.1468 と CHARMM36 力場 69 を使用して実行されました。 MDFF シミュレーションは、NVT アンサンブルで 300 K で一般化されたボルン陰的溶媒を使用して実行されました。 すべての主鎖原子は、二次構造の損失、キラリティーエラー、およびシスペプチド結合の形成を防ぐために追加の調和制約を適用して、結合定数 0.3 を使用して密度マップに適合させました。 追加のパラメータは、VMD70 の MDFF プラグインによって提供されるデフォルトとして採用されました。

AlphaFold2 で予測された gp118 構造は、ChimeraX を使用してテール密度マップに厳密にフィッティングされ、次にシース領域は ISOLDE26 のインタラクティブな分子動力学シミュレーションによって柔軟にフィッティングされました。 PHENIX71 ソフトウェア パッケージは、実空間のリファインメントに使用されました。 理想的な結合長および角度からの CC、RMSD を含む検証も、PHENIX を使用して分析されました (補足図 14、および補足表 2)。 内管のモデルを構築するために、Genbank ファイルに注釈が付けられていなかったため、最初に HMMER72 を使用して ϕKp24 のすべてのタンパク質を分析し、相同性検索によって尾管タンパク質を特定しました。 次に、Alphafold2 を使用して尾管タンパク質 gp119 の構造を予測し、これをテンプレートとして使用して内管モデルを構築しました。 モデルは、ChimeraX の尾部密度マップの対応する領域に厳密に適合され、ISOLDE で最適化され、剛体と実空間を利用する PHENIX アプリケーションで洗練されました。 理想的な結合長および角度からの RMSD を含む CC およびリファインメント統計は、PHENIX によって分析されました (補足図 20、および補足表 2)。

100 層の混合スケールの高密度ニューラル ネットワーク 39 をトレーニングして、再構成された断層像でファージ ΦKp24 尾部繊維を検出しました。 ここでは、混合スケールの高密度ネットワークを使用する他の研究と同様のトレーニング設定を使用しました56、73、74。 このトレーニング設定の詳細については、これらの以前の研究を参照してください。 トレーニングには、繊維が存在しない手動で選択された 5 つの領域に加えて、7 つのファージの尾繊維の手動セグメンテーションが使用されました。 ADAM アルゴリズム 75 は、データ拡張にランダムな回転と反転を使用してクロスエントロピー損失を最小限に抑えるために使用されました。 損失の大幅な改善が観察されなかったため、トレーニングは中止され、トレーニング時間は数時間になりました。 その後、訓練されたネットワークがすべての断層像に適用され、尾部繊維構造の 3D マップが作成されました。 これらのマップをさらに分析するために、断層像に対して追加の手動アノテーションが実行され、各ファージについて次のことが示されました: (1) 繊維構造の中心、 (2) 頭部の位置、 (3) 頭部が満たされているか空であるか、または欠落しています。 この情報を使用して、各ファージの繊維構造の 3D マップが 3D ファイバー マップから抽出され、完全な頭部を持つ 89 個のファージ、空の頭部を持つ 338 個のファージ、および頭部が欠落している 181 個のファージの個別のマップが得られました。 各グループ内のマップは、手動で注釈を付けた位置情報とその後の相互相関を最大化する自動位置合わせの両方を使用して相互に位置合わせされました。 次に、位置合わせされたマップが平均化されて、各グループの「標準的な」ファイバー形状が生成されました。 抽出された構造と平均化された構造は、Paraview76を使用して表示されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成された 3D クライオ EM マップは、クレブシエラ ジャンボ ファージの空のキャプシドに対するアクセッション コード EMD-13862 で EMDB (電子顕微鏡データ バンク、https://www.ebi.ac.uk/emdb/) に寄託されています。 ϕKp24、クレブシエラ・ジャンボ・ファージϕKp24のフルキャプシドのコードEMD-14356、および伸長尾部の長さのコードEMD-14357。 この論文で報告されたタンパク質予測データは、要求に応じて主任担当者によって共有されます。 この研究で生成された原子座標は、クレブシエラ ジャンボ ファージ ϕKp24 の空キャプシドの六量体に対するアクセッション PDB ID: 8BFL、PDB ID: で wwPDB (Worldwide Protein Data Bank、h​​ttp://www.wwpdb.org/) に寄託されています。空のキャプシド クレブシエラ ジャンボ ファージ ϕKp24 の五量体-六量体は 8BFP、拡張尾部の外側鞘の長さは PDB ID: 8AU1、拡張尾部の内管の長さは PDB ID: 8BFK。

すべての元のコードは GitHub に寄託されており、https://github.com/dmpelt/jumbo-bacteriophage、https://doi.org/10.5281/zenodo.7277351 で公開されています。 この文書で報告されたデータを再分析するために必要な追加情報は、ご要望に応じて主任担当者から入手できます。

マレー、CJ 他 2019 年の細菌の抗菌薬耐性の世界的な負担: 体系的な分析。 ランセット 399、629–655 (2022)。

Tacconelli、E. et al. 新しい抗生物質の発見、研究、開発: WHO の抗生物質耐性菌と結核の優先リスト。 ランセット感染。 ディス。 18、318–327 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

ライアン、KJ およびレイ、CG 医療微生物学。 McGraw Hill 4、370 (2004)。

Google スカラー

Ko、KS 肺炎桿菌の毒性に対する莢膜多糖遺伝子の寄与。 Virulence 8、485–486 (2017)。

論文 PubMed Google Scholar

Follador、R. et al. 肺炎桿菌の表面多糖類の多様性。 微生物。 ゲノミクス 2、e000073 (2016)。

パン、Y.-J. 他。 クレブシエラ ファージ ΦK64-1 は、複数の宿主莢膜タイプに対応する複数のデポリメラーゼをコードします。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 91、e02457–16 (2017)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

シモリューナス、E. et al. クレブシエラ ファージ vB_KleM-RaK2 - ミオウイルス科の巨大なシングルトン ウイルス。 PLoS One 8、e60717 (2013)。

論文 PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Latka, A.、Leiman, PG、Drulis-Kawa, Z. & Briers, Y. クレブシエラ ファージにおけるデポリメラーゼ含有受容体結合タンパク質の構造のモデル化。 フロント。 微生物。 10、2649 (2019)。

記事 PubMed Central PubMed Google Scholar

ヘンドリックス、RW ジャンボ バクテリオファージ。 Lesser Known Large dsDNA Viruses 229–240 (Springer Berlin Heidelberg、ベルリン、ハイデルベルク、2009)。

Yuan, Y. および Gao, M. ジャンボ バクテリオファージ: 概要。 フロント。 微生物。 8、403（2017）。

記事 PubMed Central PubMed Google Scholar

Bonilla, BE et al. 臨床病原体肺炎桿菌に感染する 4 つの新規バクテリオファージのゲノム特性評価。 （コールドスプリングハーバー研究所、2021）。

Cramer、P. AlphaFold2 と構造生物学の未来。 ナット。 構造体。 モル。 バイオル。 28、704–705 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schheres、SH RELION: クライオ EM 構造決定へのベイジアン アプローチの実装。 Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ． バイオル。 180、519–530 (2012)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Rosenthal, PB & Henderson, R. 単一粒子電子極低温顕微鏡法における粒子配向、絶対ハンド、およびコントラスト損失の最適な決定。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 333、721–745 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

クリロフ、V.、デラクルス、D.、ヘルトベルト、K.、アッカーマン、H.-W. 「φKZ様ウイルス」、提案されている新属のミオウイルスバクテリオファージ。 アーチ。 ヴィロル。 152、1955 ～ 1959 年 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Effantin、G. et al. 植物病原体 Ralstonia solanacearum に感染するジャンボ ファージ ΦRSL1 の低温電子顕微鏡による三次元構造。 ストラクチャー 21、298–305 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Neumann、E. et al. 3 つのジャンボ ファージ ヘッドの 3D 構造。 J. ヴィロル将軍。 101、1219–1226 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Suhanovsky, MM & Teschke, CM Nature のお気に入りの構成要素: HK97 フォールドによるタンパク質のフォールディングとキャプシド集合の解読。 ウイルス学 479、487–497 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

Duda、RL & Teschke、CM 驚くべき HK97 フォールド: ささやかな違いの多彩な結果。 カー。 意見。 ヴィロル。 36、9–16 (2019)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

ヘルグストランド、C. et al. タンパク質カテナンの洗練された構造: HK97 バクテリオファージのキャプシド (解像度 3.44 Å)。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 334、885–899 (2003)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ガン、L.ら。 HK97 成熟におけるカプシドの立体構造サンプリングを X 線結晶構造解析とクライオ EM で可視化しました。 構造 14、1655 ～ 1665 年 (2006)。

論文 PubMed Google Scholar

McGreevy, R.、Teo, I.、Singharoy, A. & Schulten, K. クライオ EM モデリングのための分子動力学フレキシブル フィッティング手法の進歩。 メソッド 100、50–60 (2016)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

ウィコフ、WRら。 バクテリオファージ HK97 キャプシド内のトポロジー的に結合したタンパク質環。 サイエンス 289、2129–2133 (2000)。

記事 CAS ADS PubMed Google Scholar

神谷 良 ほか単粒子極低温電子顕微鏡によるヘリコバクター ピロリ バクテリオファージ KHP30 の酸安定キャプシド構造。 構造 30、300–312.e3 (2022)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Sun, C.、Gonzalez, B.、Jiang, W. 実空間におけるヘリカル インデックス作成。 科学。 議員番号 12、8162 (2022)。

論文 CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Croll、TI ISOLDE: 低解像度の電子密度マップにモデルを構築するための物理的に現実的な環境。 アクタクリスタログル。 D 構造体。 バイオル。 74、519–530 (2018)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

ゴダードT​​D 他 UCSF ChimeraX: 視覚化と分析における現代の課題に対応します。 タンパク質科学。 27、14–25 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Robert, X. & Gouet, P. 新しい ENDscript サーバーを使用してタンパク質構造の主要な特徴を解読します。 核酸研究所 42、W320–W324 (2014)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

アクシュク、AA 他。 ミオウイルス科ファージ尾鞘タンパク質折り畳みの構造保存。 構造 19、1885 ～ 1894 年 (2011)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Zheng、W.ら。 T4 尾管の洗練されたクライオ EM 構造: 最低線量限界の探索。 構造 25、1436–1441.e2 (2017)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Ge、P.ら。 収縮前および収縮後の状態における殺菌性収縮性ナノチューブの原子構造。 ナット。 構造体。 モル。 バイオル。 22、377–382 (2015)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

ヘイマン、JB et al. セラチア・エントモフィラの毒素送達粒子抗摂食プロファージの三次元構造。 Ｊ．Ｂｉｏｌ． 化学。 288、25276–25284 (2013)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Clemens, DL、Ge, P.、Lee, B.-Y.、Horwitz, MA、Zhou, ZH T6SS の原子構造は、機能に不可欠なインターレース配列を明らかにします。 セル 160、940–951 (2015)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

クドリャシェフ、M.ら。 VI 型分泌系収縮鞘の構造。 セル 160、952–962 (2015)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Maghsoodi, A.、Chatterjee, A.、Andricioaei, I. & Perkins, NC エネルギー、力、動的経路を含むファージ T4 注入機構の仕組み。 手順国立アカデミー。 科学。 116、25097–25105 (2019)。

論文 CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Leiman, PG & Shneider, MM バクテリオファージの収縮尾機構。 上級経験値医学。 バイオル。 723、93–114 (2012)。

King、J. & Mykolajewyoz、N. バクテリオファージ T4 尾部アセンブリ: 鞘、コア、およびベースプレートのタンパク質。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 75、339–358 (1973)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kremer, JR、Mastronarde, DN & McIntosh, JR IMOD を使用した 3 次元画像データのコンピューター視覚化。 Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ． バイオル。 116、71–76 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Pelt、DM dmpelt/jumbo-bacteriophage: 初期リリース (v1.0.0)。 https://doi.org/10.5281/zenodo.7277351 (2022)。

Altschul, SF、Gish, W.、Miller, W.、Myers, EW & Lipman, DJ 基本的なローカル アライメント検索ツール。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 215、403–410 (1990)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kelley, LA、Mezulis, S.、Yates, CM、Wass, MN & Sternberg, MJ タンパク質のモデリング、予測、分析のための Phyre2 Web ポータル。 ナット。 プロトック。 10、845–858 (2015)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Baek、M.ら。 3 トラック ニューラル ネットワークを使用したタンパク質の構造と相互作用の正確な予測。 サイエンス 373、871–876 (2021)。

論文 CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Weigele, PR、Scanlon, E. & King, J. ホモ三量体、β 鎖ウイルス付着因子および尾部タンパク質。 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． 185、4022–4030 (2003)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Yan, J.、Mao, J. & Xie, J. バクテリオファージ多糖デポリメラーゼおよび生物医学的応用。 BioDrugs 28、265–274 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Schwarzer, D. et al. 多価吸着装置はファージ phi92 の広範な宿主範囲を説明し、包括的なゲノムおよび構造解析を行います。 Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． 86、10384–10398 (2012)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Cornelissen、A. et al. T7 関連シュードモナス プチダ ファージ φ15 は、ビリオン関連バイオフィルム分解特性を示します。 PloS One 6、e18597 (2011)。

論文 CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

Latka, A.、Maciejewska, B.、Majkowska-Skrobek, G.、Briers, Y. & Drulis-Kawa, Z. バクテリオファージにコードされたビリオン関連酵素は、感染プロセス中に炭水化物の障壁を克服します。 応用微生物。 バイオテクノロジー。 101、3103–3119 (2017)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Seul、A.ら。 バクテリオファージ P22 テールスパイク: 完全なタンパク質の構造とドメイン間リンカーの機能。 アクタクリスタログル。 Dバイオル。 クリスタロガー。 70、1336–1345 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

プロホロフ、NS et al. 宿主細胞吸着におけるバクテリオファージ G7C エステラーゼ テールスパイクの機能。 モル。 微生物。 105、385–398 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

プラットナー、M.ら。 バクテリオファージ CBA120 の分岐受容体結合複合体の構造と機能。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 431、3718–3739 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zimmermann、L.ら。 新しい HHpred サーバーを中心に完全に再実装された MPI バイオインフォマティクス ツールキット。 Ｊ．Ｍｏｌ． バイオル。 430、2237–2243 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジャック、DA et al. HIV-1 は、動的キャプシド細孔を使用してヌクレオチドを取り込み、キャプシド化 DNA 合成を促進します。 ネイチャー 536、349–353 (2016)。

論文 CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

リーマン、PG et al. VI 型分泌装置とファージ尾部関連タンパク質複合体は、共通の進化的起源を共有しています。 手順国立アカデミー。 科学。 106、4154–4159 (2009)。

論文 CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

記録、AR VI 型分泌システム: ファージ様機構を備えた多目的送達システム。 モル。 植物微生物の相互作用。 24、751–757 (2011)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Basler, M. VI 型分泌システム: 収縮性ナノマシンによる分泌。 フィロス。 トランス。 R. Soc. B: バイオル。 科学。 370、20150021 (2015)。

記事 Google Scholar

Pelt, DM & Sethian, JA 画像解析用の混合スケールの高密度畳み込みニューラル ネットワーク。 手順国立アカデミー。 科学。 115、254–259 (2018)。

論文 MathSciNet CAS ADS PubMed Google Scholar

Finn、RD、Clements、J. & Eddy、SR HMMER Web サーバー: インタラクティブな配列類似性検索。 核酸研究所 39、W29–W37 (2011)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

ゲイブラー、F.ら。 MPI バイオインフォマティクス ツールキットを使用したタンパク質配列解析。 カー。 プロトック。 バイオインフォマティクス 72、e108 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

DN 州マストロナルデ 試料の動きの確実な予測を使用した自動電子顕微鏡断層撮影法。 Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ． バイオル。 152、36–51 (2005)。

論文 PubMed Google Scholar

Hagen, WJ、Wan, W. & Briggs, JA 高解像度サブトモグラムの平均化に最適化されたクライオ電子断層撮影傾斜スキームの実装。 Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ． バイオル。 197、191–198 (2017)。

記事 PubMed Central PubMed Google Scholar

シンデリン、J.ら。 フィジー: 生物学的画像解析のためのオープンソース プラットフォーム。 ナット。 メソッド 9、676–682 (2012)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zheng、SQら。 MotionCor2: 改善されたクライオ電子顕微鏡のためのビーム誘起運動の異方性補正。 ナット。 方法 14、331–332 (2017)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: 電子顕微鏡写真からの高速かつ正確な焦点ぼけ推定。 Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ． バイオル。 192、216–221 (2015)。

記事 PubMed Central PubMed Google Scholar

Russo, CJ & Henderson, R. Ewald の単側波帯画像処理アルゴリズムを使用した球面補正。 超顕微鏡法 187、26–33 (2018)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Kucukelbir, A.、Sigworth, FJ & Tagare, HD クライオ EM 密度マップの局所解像度を定量化します。 ナット。 方法 11、63 ～ 65 (2014)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ジャンパー、J. et al. AlphaFold による高精度なタンパク質構造予測。 Nature 596, 583–589 (2021)。

論文 CAS PubMed Central ADS PubMed Google Scholar

シンハロイ、A.ら。 分子動力学に基づいたサブ 5 Å クライオ電子顕微鏡マップの改良と検証。 Elife 5、e16105 (2016)。

記事 PubMed Central PubMed Google Scholar

フィリップス、JC et al. NAMD によるスケーラブルな分子動力学。 Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ． 化学。 26、1781–1802 (2005)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Huang, L. & Roux, B. ab initio ターゲット データに基づく非分極性および分極性原子モデルのための自動化された力場パラメーター化。 Ｊ．Ｃｈｅｍ． 理論計算。 9、3543–3556 (2013)。

記事 CAS Google Scholar

Humphrey, W.、Dalke, A. & Schulten, K. VMD: 視覚的分子動力学。 Ｊ．Ｍｏｌ． グラフ。 14、33–38 (1996)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アフォニン、PV 他。 PHENIX におけるクライオ EM および結晶学のための実空間リファインメント。 アクタクリスタログル。 宗派。 D: 構造体。 バイオル。 74、531–544 (2018)。

記事 CAS Google Scholar

ポッター、SC et al。 HMMER Web サーバー: 2018 アップデート。 核酸研究所 46、W200–W204 (2018)。

論文 CAS PubMed Central PubMed Google Scholar

Pelt, DM、Batenburg, KJ & Sethian, JA 混合スケールの高密度畳み込みニューラル ネットワークを使用して、限られたデータから断層撮影の再構成を改善します。 J. イメージング 4、128 (2018)。

記事 Google Scholar

セゲブ・ザルコ、L.-a. 他。 混合スケールの高密度神経ネットワークを使用したクライオ電子断層撮影法により、トキソプラズマ侵入機構の展開における重要なステップが明らかになります。 PNAS Nexus 1、pgac183(2022)。

Kingma, DP & Ba, J. Adam: 確率的最適化の手法。 https://arxiv.org/abs/1412.6980 (2014)。

Ahrens, J.、Geveci, B.、Law, C. Paraview: 大規模データ視覚化のためのエンドユーザー ツール。 視覚化ハンドブック 717 (2005)。

リファレンスをダウンロードする

この研究は、プロジェクト番号 184.034.014 の研究プログラム「大規模研究インフラのための国家ロードマップ 2017 ～ 2018 年」の一部であり、オランダ研究評議会 (NWO) から一部資金提供を受けています。 CKC と PJS は、BBSRC、MRC、Wellcome から資金提供を受けています。 デポリメラーゼの実験と分析は、ポーランド国立科学センターによって支援され、助成番号 UMO-2017/26/M/NZ1/00233 がアラバマ州 ZD-K. に、UMO-2020/38/E/NZ8/00432 が AOAL に与えられました。研究財団フランダース (FWO) の補助金番号 1240021 でジュニア博士研究員フェローシップを保持しています。NDMP は、補助金番号 016.Veni.192.235 で NWO によって支援されています。 SJJB は、NWO によって VICI 助成金 VI.C.182.027 によって支援され、欧州研究評議会 (ERC) CoG によって助成金番号 182.027 によって支援されています。 101003229。RO は、プロジェクト番号 201906280465 で中国奨学会 (CSC) の支援を受けました。クライオ EM サンプルの準備については、Jamie Depelteau と Adam Sidi Mabrouk に感謝します。 Wen Yang と Willem Noteborn がクライオ EM データ収集に協力。 ルドヴィック・ルノーとフレデリック・ボネットがクライオEMデータ処理を支援。 Boris Estrada-Bonilla の技術サポート。 Xiao Zhang にはネットワーク結果の抽出について協力していただき、Lei Zhang には原稿に対する批判的なフィードバックを提供していただきました。 この研究で使用した肺炎桿菌参照株（CIP標識株）は、パスツール研究所（CIP、パリ、フランス）から入手しました。

MOE 非平衡合成および凝縮物質変調重点実験室、西安交通大学物理学部、西安市西安西路 28 号、710049、中国

欧陽若城

ライデン大学生物学研究所微生物科学部、Sylviusweg 72、2333 BE、ライデン、オランダ

ルオチェン・オウヤン、ベラ・CJ・ウィリアムズ、アリアン・ブリーゲル

デルフト工科大学バイオナノサイエンス学部、Van der Maasweg 9、2629 HZ、デルフト、オランダ

アナ・リタ・コスタ & スタン・J・J・ブラウンス

カブリナノサイエンス研究所、デルフト、オランダ

アナ・リタ・コスタ & スタン・J・J・ブラウンス

オックスフォード大学生化学教室、オックスフォード、英国

C. キース・キャシディ

病原体生物学および免疫学部、ヴロツワフ大学、Przybyszewskiego 63-77、51-148、ヴロツワフ、ポーランド

アレクサンドラ・オトウィノフスカ、アグニエシュカ・ラトカ、ズザンナ・ドゥルリス・カワ

ゲント大学バイオテクノロジー学部、Valentin Vaerwyckweg 1、9000、ゲント、ベルギー

アグニエシュカ・ラトカ & イヴ・ブライヤーズ

生命科学部および化学学部、ウォリック大学、コベントリー、CV4 7AL、英国

フィル・J・スタンスフェルド

ライデン先端コンピュータサイエンス研究所、ライデン大学、Niels Bohrweg 1、2333CA、ライデン、オランダ

ダニエル・M・ペルト

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

概念化: AB、SJJB、YB、ZDK。 方法論: AB、RO、YB、ZDK、CKC; ソフトウェア: RO、CKC; 正式な分析: RO、CKC、DMP、AL、AO、VW。 調査：RO、ARC、CKC、AO。 リソース: AB、SJJB、DMP、YB、ZDK。 データキュレーション: RO、AB、YB、ZDK。 原案執筆：RO、AB、YB、DMP、ZDK。 執筆—RO、ARC、CKC、VW、PJS、DMP、SJJ、YB、AL、ZDK、AOのレビューと編集。 視覚化: RO、VW、YB。 監修：AB、SJJB、YB、ZDK プロジェクト管理: AB; 資金調達: AB、SJJB、CKC、PJS、ZDK、AL、DMP、OR

アリアン・ブリーゲルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Guy Schoehn と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Ouyang、R.、Costa、AR、Cassidy、CK 他。 多分岐尾繊維を使用した莢膜細菌に感染するジャンボ バクテリオファージの高解像度再構成。 Nat Commun 13、7241 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-34972-5

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 4 月 13 日

受理日: 2022 年 11 月 14 日

公開日: 2022 年 11 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34972-5

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティ ガイドラインに従うことに同意したことになります。 虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。