光遺伝学的および薬理学的介入はマウスのヒポクレチンニューロンと衝動性を結びつける

May 22, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 74 (2023) この記事を引用する

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オレキシンとしても知られる神経ペプチドヒポクレチンを発現する外側視床下部のニューロンは、覚醒安定性の重要な調節因子として知られています。 しかし、注意や意思決定など、覚醒構造のさまざまな要素におけるそれらの役割はほとんど理解されていません。 今回我々は、マウスのGo/NoGo課題における停止動作の衝動性におけるヒポクレチン神経回路のダイナミクスを研究した。 私たちは、ヒポクレチンのニューロン活動が報酬の期待と相関していることを示します。 次に、Go/NoGo タスクにおける光遺伝学を使用して、ヒポクレチン ニューロン活動の因果関係を評価しました。 我々は、合図期間中にヒポクレチンニューロンを刺激すると、早期反応の数が劇的に増加することを示した。 これらの効果はアンフェタミンによって模倣され、ノルエピネフリン取り込み阻害剤であるアトモキセチンによって軽減され、ヒポクレチン受容体 1 選択的アンタゴニストによってブロックされます。 我々は、ヒポクレチンニューロンが、覚醒中の顕著な刺激の統合において重要な役割を果たし、報酬や嫌悪の合図に対して適切かつタイムリーな反応を生み出すと結論付けた。

オレキシンとしても知られるヒポクレチン (Hcrt) は、同じ前駆体に由来する 2 つの神経ペプチドです1、2。 Hcrt ペプチドを産生するニューロンは視床下部外側領域に限定されていますが、その投影は脳全体に広く広がっています 3。 これまでの研究では、Hcrt システムの完全性が覚醒の安定性に不可欠であることが示されています。 イヌ、マウス、ヒトにおける Hcrt ニューロンの喪失は、脱力発作を伴うナルコレプシーを引き起こします。 この安定性は、局所視床下部結合および海馬、中隔、扁桃体からの求心性神経からの複数の変数を統合することによって発揮されると考えられています4。

覚醒状態の移行における実証された役割に加えて、複数の証拠により、ヒポクレチン/オレキシン系が脳報酬の処理における重要な中継器であることが証明されています5,6。 私たちと他の人々は、Hcrt R 拮抗作用が報酬を求める動機を低下させ 7、コカインを求めるストレスの回復をブロックすることを示しました 8,9。 この効果は、HcrtR1 シグナル伝達 13,14 を介した Hcrt 放出 10,11,12 によって引き起こされるドーパミン作動性興奮性の長期にわたる増加によるものと考えられます。

衝動性は、予見や結果を考慮しない行動として定義されることが多く、依存症や双極性障害を含む多くの精神疾患の本質的な特徴です15、16。 覚醒と依存症に共通する重要な特徴は、適切な目標指向の決定を行うための顕著な信号の統合にあります。 我々は以前、Hcrt ニューロンの活動が正と負の両方の価数の刺激への曝露と相関していることを示しました 17,18。 ただし、これらの刺激によって誘発される Hcrt 活性が意思決定に影響を与えるかどうかは不明です。 今回我々は、確立されたGo/NoGoタスク中に薬理学と光遺伝学を使用してHcrtシステムを調節することにより、意思決定と行動の衝動性におけるHcrt活性の役割を研究しました。

ファイバー測光法を使用して、Go/NoGo タスクにおける Hcrt ニューロンの活動を監視しました。 Hcrt-IRES-creノックインマウス18をGo/NoGoタスクで最大70％の精度で訓練し、GCamp6fをコードするウイルスベクターを注入し、視床下部外側に光ファイバーを埋め込みました（補足図3）。 Go/NoGo タスク全体を通して Hcrt ニューロン活動を記録し、タスクフェーズ (Precue、Go および NoGo キュー、報酬、ITI) 間の移行中の信号変化をオフラインで分析しました。 図 1A および D に示すように、カルシウム反応は、特に Go キューに正しく反応した動物で、プレキューからキュー期間への移行時に増加する傾向がありました (時間 x 移行相互作用 F(1,4) = 2.69、p = 0.10 ）。 正しい Go トレースは Precue とは大きく異なりました (図 1D; p = 0.03)。 このシグナルは、NoGo Cue 期間中に観察される低レベルのアクティビティとは対照的です (図 1B)。 誤った反応を示した動物は、キュー曝露時にカルシウムシグナルに中程度ではあるが有意な差を示し、これは顕著な刺激に対する反応と一致しました 18。 カルシウムシグナルはゴーキュー期間中に徐々に増加し、報酬の送達と同時にピークレベルに達しました（図1B）（時間F（1,4）= 9.27、p = 0.04）。 対照的に、Hcrt ニューロンのカルシウム活性プロファイルは、NoGo キュー中は低いままでしたが、ノーズポークの直後にピークも示しました。 報酬から試験終了までの試験間期間への移行でも、活動のピークが示されました (図 1C、F) (時間 F(1,4) = 7.88、p = 0.048) が、どちらも正しいです。 Go グループと NoGo グループは同様の反応を示しました (時間 x 遷移 F(1,4) = 0.007、p = 0.94)。 野生型（Hcrt-IRES-cre-）マウスでは蛍光シグナルは検出されませんでした（補足図1）。

Go/NoGo タスクの (A、D) Precue から Cue、(B、E) Cue から Reward、または (C、F) Reward から ITI への遷移の 5 秒前および 5 秒後の Hcrt ニューロンからの平均 ΔF/F。 A-C 時間 0 と垂直点線は遷移点を示します。 色の色合いは、Go/NoGo タスクにおける動物の反応を示します。 網掛けの領域は SEM を表します。 下の行 (D ～ F) は、上でラベル付けされた遷移の 1 秒前と 1 秒後の平均信号を表示します。 * はグループ間の差異を示します (ボンフェローニの検定、p < 0.05)。

Hcrt 活動のピークが衝動的行動の原因であるかどうかを判断するために、Go および NoGo 合図の最初の 5 秒間に Hcrt ニューロンの光遺伝学的刺激を使用しました。 5 Hz および 10 Hz での Hcrt ニューロン 19 の in vivo 記録と一致するパラメーターを選択しました。 Go キュー中の刺激は応答数に有意な影響を与えませんでした (P > 0.05) (図 2A)。 ただし、NoGo キュー中の Hcrt 刺激は、正しい NoGo トライアルの確率を劇的に低下させました (ボンフェローニ多重比較による p < 0.001 RM-ANOVA) (図 2B; 補足ムービー 1 および 2)。 興味深いことに、プレキュー期間中のHcrtの光遺伝学的刺激は、Hcrt-cre動物でも同様に早期応答を増加させたが、野生型対照マウスでは増加させなかった(P>0.05、RM-ANOVA)(図2C)。 これらの結果は、Hcrt ニューロンが報酬に関連する顕著なシグナルに応答し、行動抑制が必要な場合には活動が抑制されることを強く示唆しています。

Hcrt ニューロンの 5 または 10 Hz の光遺伝学的刺激が Go/NoGo 行動に及ぼす影響。 Hcrt 刺激は正しい Go 応答の確率には影響しませんが、(B) 正しい NoGo 応答の確率が低下し、(C) プレキュー応答率が増加します。 Hcrt-cre- コントロール (灰色) では効果は見られません。 色は遺伝子型を示し、陰影はレーザー周波数を示します。 * は同じ遺伝子型内のレーザーなし対照試験との差を示し (ボンフェローニの検定、p < 0.05)、† はその特定のレーザー周波数での Hcrt-cre- 対照との差を示します。 箱ひげ図は平均と標準偏差を示します。 ひげは最大値と最小値にまたがります。

Hcrt は、Hcrt1 と Hcrt2 に異なって結合する 2 つの GPCRS に作用します。 ノックアウト動物での研究では、HcrtR1 と HcrtR2 シグナル伝達の両方が睡眠/覚醒の安定性に影響を与えるのに対し 20、HcrtR1 は脳の報酬機能への影響を調節することが示されています 21。 したがって、我々は選択的HcrtR1アンタゴニストを使用して、HcrtR1シグナル伝達が衝動性に対するHcrtの効果に必要であるかどうかを試験した。

HcrtR1 アンタゴニストの効果を校正するために、さまざまな用量のアンフェタミンを注射した後の Go/NoGo 課題に対する動物の反応を評価しました (図 3A、D、G) (アッセイの 10 分前に 1 および 2.5 mg を投与、衝動的な選択を増加させることが知られている精神刺激薬 22 または、Go/NoGo 課題のパフォーマンスを向上させるノルアドレナリン再取り込み阻害剤であるアトモキセチン (図 3B、E、H) 23。実際、アンフェタミンによる治療は、用量依存的に NoGo 確率を低下させました (P < 0.05 RM- ANOVA) (図 3D)、一方、アトモキセチンはマウスの成績をわずかに改善しました (P < 0.05 RM-ANOVA) (図 3B、H)。 Pre-Cue 応答率 (P < 0.05 RM-ANOVA) (図 3F、I)。

アンフェタミンは、正しい NoGo 応答率 (D) を低下させ、PreCue 応答率 (G) を増加させますが、正しい Go 応答率 (A) は変更しません。 対照的に、アトモキセチンは正しい Go 応答率 (B) を増加させ、PreCue 応答率 (H) を低下させますが、正しい NoGo 応答率 (E) は変化させません。 選択的 HcrtR1 拮抗作用は、Go 正解率 (C) および PreCue 反応率 (I) を低下させ、NoGo 正解率 (F) を増加させます。 ビヒクルデータはアンフェタミン群とアトモキセチン群（IP送達）間で共有され、HcrtR1アンタゴニストデータは同じモダリティ（経口強制経口）で送達されたビヒクルと比較されます。 * はビヒクル処理との差を示します (Bonferroni の検定、p < 0.05)。 箱ひげ図は平均と標準偏差を示します。 ひげは最大値と最小値にまたがります。

次に、光遺伝学的 Hcrt 刺激とアンフェタミン (図 4A、D、G)、アトモキセチン (図 4B、E、H)、または選択的 HcrtR1 アンタゴニスト (図 4B) による全身薬理学的治療後の Go/NoGo パラダイムにおけるオペラント応答を比較しました。 .4C、F、I）。 preCue期間中の早期反応の確率は、Hcrt神経刺激と同様に、アンフェタミンの全身投与によって増加しました（図4G）（P < 0.05治療の主効果、二元配置RM-ANOVAの遺伝子型）。 対照的に、注意力を高め、衝動性を低下させることが知られているノルアドレナリン取り込み阻害剤であるアトモキセチンによる治療 24 は、Hcrt 光刺激の効果を部分的に回復しました（図 4E、H）（P < 0.05 主効果、および二元性 RM における治療と遺伝子型の相互作用） -ANOVA)。 HcrtR1アンタゴニストは、Hcrt刺激によって誘発される早期応答の増加を完全に回復した(図4F)(P<0.05の主効果および二元配置RM-ANOVAにおける治療と遺伝子型の相互作用)。

さまざまな用量でのアンフェタミン (A、D、G)、アトモキセチン (B、E、H)、または HcrtR1 アンタゴニスト (C、F、I) の投与と同時に 10 Hz Hcrt 刺激を行った場合の、正しい Go 反応率 (A、A、 B、C、Go Cue 期間の最初の 5 秒間に送達された刺激）、正しい NoGo 応答率（D、E、F、NoGo Cue 期間の最初の 5 秒間に送達された刺激）、PreCue 応答率（G、 PreCue 期間の最後の 5 秒間に送達された H、I、刺激が表示されます。 色は遺伝子型を示し (hcre-cre+ の場合は紫色、対照の場合は灰色)、陰影は用量を示します (用量が多いほど暗くなる)。 ビヒクルデータはアンフェタミン群とアトモキセチン群（IP送達）間で共有され、HcrtR1アンタゴニストデータは同じモダリティ（経口強制経口）で送達されたビヒクルと比較されます。 * は同じ遺伝子型内のビヒクルとの違いを示します (Bonferroni の検定、p < 0.05)。 † は、その特定の用量における Hcrt-cre- 対照との差を示します (ボンフェローニの検定、p < 0.05)。

意思決定の障害につながる衝動性は、注意欠陥/多動性障害、摂食障害、薬物乱用障害など、多くの精神障害や行動障害と関連しています25、26、27。 複数の研究により、カフェイン摂取、睡眠不足、リスク行動、衝動性との関係が確立されています 28,29 が、そのような関係の神経機構は不明です。 ヤークス・ドットソンの法則は、生理学的覚醒とパフォーマンスの間には、ある時点までは関係があり、過剰な覚醒はパフォーマンスの低下につながると述べています。 実際、Hcrt 欠損ナルコレプシー患者の覚醒低下が注意欠陥を引き起こすという証拠が存在します 30。 今回我々は、マウスのパフォーマンスと運動衝動性行動を評価するためにGo/NoGoタスクを使用し、神経ペプチドHcrtによって引き起こされる覚醒がYerkes-Dodsonの法則に従うかどうかをテストしました。 我々は、Hcrt ニューロンの位相活動プロファイルと一致する周波数での Hcrt ニューロンの光遺伝学的刺激によって誘発される過覚醒も注意力を低下させることを示します 31,32。

Hcrt 活性によって引き起こされる衝動性の増加は、HcrtR 二重アンタゴニストであるスボレキサントによる治療によりコカインに対する衝動性が減少することを示す他の報告と一致しています 33。 Hcrt ニューロンは、正と負の両方の価数の顕著な刺激によって活性化されるようです 17,18。 したがって、Hcrt 活動は、モノアミン作動性覚醒回路を迅速に作動させる警告/緊急信号として解釈される可能性があります。 cFos を使用して、Freeman et al. 34 は、内側の視床下部 Hcrt ニューロンの活性化は、Go/NoGo タスクにおいてより高い精度で相関しているが、外側の視床下部 Hcrt ニューロンは活性化していないことを示しました。 cFos 免疫反応性の時間分解能が低いため (Go/NoGo セッション後 60 分)、我々の研究と直接比較することができません。 私たちの結果の限界の 1 つは、組織の品質が低いため、正確なカニューレの配置を解剖学的に検証できなかったことです。 ただし、光遺伝学実験の前に、10 Hz 刺激後の睡眠/覚醒遷移をモニタリングすることにより、正確な配置をテストしました。 この方法は、以前の研究で非常に信頼性が高いことが証明されました17。 また、新しい動物における注入条件の精度と導入遺伝子の共所発現も検証しました（補足図2および3）。

Hcrt ニューロンによって誘発される衝動性を引き起こすメカニズムはどれですか? Go/NoGo の根底にある神経回路は、ヒト 35,36 およびげっ歯類 26,27 の覚醒剤依存症で損なわれることが知られている脳システムの機能的および構造的完全性の両方に関連しています。 習慣が形成された後に行動を抑制する能力は、古典的に、腹側被蓋野 (VTA) と側坐核 (NAcc) シェルの間のニューロン ループ、および皮質線条体のループに関連付けられています。 しかし、これらの構造が覚醒と注意によってどのように調節されるかはまだ十分に理解されていません。 NAcc 殻と VTA の間の相互作用は、待機衝動性の主な基質として提案されており、それによって VTA ニューロンが NAcc 殻の GABA 作動性細胞に投射し、その細胞が VTA の GABA 介在ニューロンに戻って投射します。 衝動的な時期尚早の反応は、コアでのドーパミン放出の減少とシェルサブ領域でのドーパミン放出の増加に関連しています37。 実質的な証拠は、Hcrt、NAcc シェル内の D2 受容体含有ニューロンと VTA 間の相互接続を示しています。 Hcrt1 は、外側および内側の NAcc シェルニューロンの発火を増加させます 38。 最近、ゴンザレスら。 ３９は、Ｈｃｒｔニューロンが食物に近づく間に活動を増加させ、この活動が、ＮＡｃｃのシェルとＨｃｒｔニューロンとの間の相互作用によって媒介される、完了行動の開始時にベースラインまで低下することを示した。 Hcrt R1 ノックアウトマウスは軽度の睡眠表現型を持っているため、Hcrt R1 アンタゴニストの治療後に観察された正しい Go 応答の低下 (図 2C) は、眠気の増加による可能性は低いです 20。 むしろ、これらのマウスは、HcrtR1 が食物強化反応、動機付け、またはその両方に必要であることを示しています 21。 ブロメリーら。 40は、直接的なHcrt→D2興奮性回路を記述し、D2細胞活性がマウスにおけるHcrt依存性の先天的リスク回避に必要であることを示した40。 LH内のHcrt+によって同時放出されるダイノルフィンは、内側NAcc殻および基底外側扁桃体に投射するドーパミンニューロンの大部分を阻害するが、外側NAcc殻に投射するニューロンのごく一部でのみ発火を低下させる。 カッパオピオイド受容体の活性化は、5CSRRT41 の衝動性を増加させることが示唆されています。 Hcrt ニューロンの光遺伝学的刺激により、ダイノルフィンの放出が増加した可能性があります 42,43。 したがって、NAcc 殻での Hcrt 放出によって誘発される E/I 比の変化は、D2 ニューロンまたは NPY + 介在ニューロン上の Hcrt 受容体に結合することによって早期応答を誘発する可能性があると考えられます。 VTA ニューロンの化学遺伝学的活性化は衝動性に影響を与えないため、NAcc における Hcrt の神経調節効果は特異的であると思われることは注目に値します 44,45。 Hcrt 活性は視床下部出力の E/I バランスも変化させる可能性があります。LH(GAD65) ニューロンの興奮は運動活動の亢進を誘導しますが、LH(GAD65) ニューロンの自然な活動の阻害は自発的な運動を抑制します 46。 したがって、Hcrt → LH(GAD65) 回路は、実行するドライブの作成を支援する可能性があり、早期応答の増加として Go/NoGo アッセイに反映されます。

標準的な VTA→NAcc シェル回路に加えて、光遺伝学的 Hcrt 刺激は青斑核 (LC)47 を活性化します。この青斑核は、前頭前皮質 (PFC)48 または NAcc49 でのノルアドレナリン放出によって媒介される衝動的行動にも関与する構造です。 NAcc 殻におけるノルエピネフリン (NE) 放出は、衝動性に対するアトモキセチンの影響において重要な役割を果たしますが、PFC における NE は、衝動行動に対するアンフェタミンの影響を弱めます。 Hcrt 光遺伝学的刺激は衝動性に対するアンフェタミンの効果を変化させなかったので、NE は NAcc における Hcrt 作用を調節すると考えられます。

ファイバー測光法を使用して、我々は、視床下部外側部の Hcrt ニューロン活動が Go トライアルで報酬を与えるときにピークに達することを示しました。これは、選択課題の全体的な記録でニューロンの 74% が発火率を増加させたと報告されているのと一致しています 50。 Burdakovらによる最近の研究。 46 および私たち自身の研究室 17 は、Hcrt ニューロンが複数の顕著な刺激に敏感であり、Go セッション中の Ca2+ 濃度の増加がそのような顕著性を反映している可能性があることを示しています (図 1)。 注意に決定的に関与する脳構造である青斑核における TH + ノルアドレナリン作動性ニューロンの反応を記録したときにも、同様の測光プロファイルが観察されました。 私たちの研究室のこれまでの研究では、Hcrt ニューロンが LC に密に投影しており、LC ニューロンの活動を光遺伝学的に遮断することで Hcrt 誘発の睡眠から覚醒への移行が妨げられることが示されました 47。 Hcrt ニューロンと LC ニューロンの測光プロファイルは、正しい NoGo トライアル中と NoGo セッションの早期応答中に記録された場合も同様でした。 HcrtLC の関連は、報告されている LC での発現パターンに基づくと、HcrtR1 受容体を介してシグナル伝達される可能性があります 51,52。 したがって、HcrtR1 アンタゴニストは、アンフェタミンによって引き起こされる早期反応を軽減することができました。

ADHD は、発達上不適切なレベルの不注意、衝動性、および/または多動性を特徴とし、この障害を持つ成人の治療にはアトモキセチンやその他の興奮剤が使用されています53。 実際、今回我々は、ノルアドレナリン作動性取り込み阻害剤であるアトモキセチンが、光遺伝学的Hcrt刺激によって誘発された衝動性の後の正常な反応を部分的に回復させることを示す。 選択的 Hcrt R1 アンタゴニストは、衝動性テストにおける抑制的行動の可能性を救うのにより効果的であると考えられ、不適応衝動性を伴う精神疾患の治療における臨床応用の可能性を示唆しています。

ここで我々は、Hcrt ニューロンの活性化と、衝動性の待機および停止の両方との間の因果関係を実証しました。 Hcrt ニューロンの光遺伝学的刺激は NoGo 試験における早期反応を増加させましたが、HcrtR1 選択的アンタゴニストは Go/NoGo 課題に対するアンフェタミンの効果を減少させました。 この効果は、線条体および PFC におけるドーパミン作動性およびノルアドレナリン作動性のメカニズムを介して媒介される可能性があります。 この課題に対する HcrtR1 アンタゴニストの堅牢性と特異性により、HcrtR1 アンタゴニストは ADHD や衝動性に関連するその他の障害を治療するための優れた薬理学的ツールとなります。

すべての実験は、米国国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドのガイドラインに従って実行され、実験動物の管理に関するスタンフォード大学管理パネル (プロトコル ID #18787) によって承認されました。

動物には、順序効果から保護するためにランダムな順序で各薬剤/用量を投与し、十分な洗い流しを考慮して治療日の間に少なくとも 3 日間の間隔をあけた。 アトモキセチン塩酸塩は Sigma (Y0001586) から入手し、0.9% NaCl (生理食塩水) に溶解し、Go/NoGo の開始 30 分前に 5 mg/kg または 10 mg/kg の用量で腹腔内注射により投与しました。テスト。 D-アンフェタミンヘミ硫酸塩は Sigma から入手し (A5880)、0.9% NaCl (生理食塩水) に溶解し、Go/kg の開始 10 分前に 1 mg/kg または 2.5 mg/kg の用量で腹腔内注射により投与しました。 NoGo テスト 22,54)。 さらに、HcrtR1アンタゴニストはベーリンガーインゲルハイムから入手し（特許WO2017/178339）、0.5％ヒドロキシエチルセルロース（Sigma、525944）および0.015％Tween 80（Sigma、P1754）の水に溶解し、経口強制経口投与により、 2.5 mg/kg、7.5 mg/kg、または 12.5 mg/kg のいずれか。 7 つの薬物/用量グループに加えて、マウスに Go/NoGo テスト開始の 10 分前に生理食塩水を腹腔内注射するか、HcrtR1 化合物の経口投与に使用するビヒクル溶液を投与する 2 つの対照グループが含まれました。 Go/NoGo テスト開始の 60 分前に強制経口投与。

C57BL6J バックグラウンド (N9) に戻し交雑した雄 Hcrt-IRES-Cre ノックイン ヘテロ接合体マウス (Hcrt-cre +) を屋内で飼育し、野生型同腹子 (Hcrt-cre-) を対照として使用しました。 マウスは、安定した温度（22±1℃）、湿度（40～60％）、照明条件（午前9時～午後9時は暗く、9：00）のプレキシガラス室で最大5匹のグループに分けて飼育されました。午後00時～午前9時は明るい）。 訓練開始時のマウスの体重は約 27 g でした。 訓練中、マウスは水制限パラダイムに移行し、活動期間の終わりに 2 ～ 4 時間水にアクセスできるようになりました。 すべてのトレーニング、記録、操作は暗黒時代に行われました。

マウスをケタミン (100 mg/kg) とキシラジン (20 mg/kg) の混合物で麻酔し、動物定位固定フレーム (David Kopf Instruments) に取り付け、0.3 μl AAV-DJ-EF1α-DIO-hChR2( H134R)-eYFP ウイルス (1 ml あたり 2.5 × 1012 ゲノム コピー、スタンフォード ウイルス コア) を右または左視床下部外側 (LH) (AP: − 1.35 mm、ML: ± 0.95 mm、DV: −5.15 mm) に 5 μlハミルトンマイクロシリンジ。 光遺伝学的刺激のために、ガラス繊維（直径２００μｍ、カナダ、ケベック州フランケットのドリックレンズ社）を、先端が注射部位の真上に埋め込まれた。 ファイバー測光のために、GCaMP6f をコードする遺伝子を運ぶ 0.3 μl AAV ベクター (AAV-DJ-EF1α-DIO-GCaMP6f、1 ml あたり 1.1 × 1013 ゲノム コピー、Stanford Virus Core) を右または左 LH (AP:-1.35 mm、 ML：±0.95mm、DV：-5.15mm）を5μlハミルトンマイクロシリンジで注入し、後のGCaMP6fシグナル取得のために注入部位にガラスファイバー（直径400μm、NA0.48、ドーリックレンズ）の先端を埋め込んだ。 。 Hcrt-cre+ および Hcrt-cre- (対照) マウスには同一のウイルス治療を受けました。

動物はまず、鼻突き報酬ポートを確実に調査し（セッションあたり200回以上の鼻突き）、報酬期間中に確実に鼻突きを行うまで、ランダム間隔60秒のスケジュールで訓練することにより、報酬の送達がどこで行われるかを学習するように訓練されました（報酬期間の ~80% が少なくとも 1 回の鼻突きを示すまで)。 これに続いて、マウスは、40 分間または Go Cue トライアルのみの 60 回のトライアル (いずれか早い方) のセッションで「Go Cue」のトレーニングを受けました。 マウスが Go Cue に確実に反応すると (連続 3 日間のトレーニングで Go Cue に対する正確な反応が 70% 以上)、40 分/60 回の試行セッションが 50% Go 試行のランダムな分布になるように「NoGo Cue」を導入しました。 50% NoGo トライアル。 マウスが Go と NoGo の両方の合図に確実に正確に反応すると (連続 3 日間のトレーニングで合図に対して 70% を超える正答率)、マウスはテストの準備ができているとみなされました。 信頼性の高い精度は、定期的なトレーニング (週に少なくとも 5 日) によりテスト日の間に維持されました。マウスは、最新のトレーニング セッションで Go と NoGo の両方の合図に対して 70% 以上の精度が示された場合にのみテストされました (図 5)。

可変長のプレキュー期間 (持続時間 9 ～ 24 秒、ケージのライトがオン) の後、Go および NoGo 期間 (持続時間 10 秒またはノーズポークまで、ケージのライトがオン) が、明確な聴覚キューを介して動物に通知されます。 ITI は試行間間隔 (期間 10 秒、ケージのライトはオフ) を表します。 プレキュー期間中の時期尚早な応答とキュー期間中の誤った応答は、報酬期間の終了と同様に、ITI への進行を引き起こします (期間 3 秒、ケージのライトがオン)。 影付きのボックスは、間違った応答を示します。

以下のパラメータがセッションごとに計算されました。 ヒット数: 特定のセッションの囲碁試行の合図期間中に動物がノーズポークを行った回数。 False Alarms: NoGo キュー期間中に動物が鼻突きをした NoGo トライアルの数。 プレキュー応答率: すべてのプレキュー期間中に行われた応答の合計数を、すべてのプレキュー期間の合計期間で割ったもの。 キューのプレゼンテーション中にポークが発生しなかった場合、値は最大レイテンシー (キューのプレゼンテーションの最大時間) に設定されます。

ファイバー測光記録のために、Hcrt-cre+ および Hcrt-cre- マウスを柔軟な記録ケーブルに接続し、オペラント チャンバーに配置しました。 そこで、GCaMP6f シグナルを 12 分間記録し、マウスがタスクを実行せずにオペラント ケージ内で休んでいる間に 1 分間のベースライン記録を行い、その後 10 分間の Go/NoGo トライアル (Go トライアルと NoGo トライアルの比率 50:50) を記録しました。 、その後さらに 1 分間のセッション後の録画が続きます。 録音は、前述の機器を使用してキャプチャされました55、56。 簡単に説明すると、カスタム Matlab プログラム (MathWorks、米国マサチューセッツ州ナティック) と多機能データ収集デバイス (NI USB-6259、National Instruments、米国テキサス州オースティン）。 励起光はGFP励起フィルタ(MF469-35、当社)を通過し、ダイクロイックミラー(MD498、当社)で反射され、ファイバーコリメーションパッケージ(F240FC)を介して低蛍光パッチコード(400 µm、0.48 NA; Doricレンズ)に入ります。 -A、当社)。 パッチコードは、ジルコニアスリーブ (SLEEVE_ZR_2.50、Doric Lenses) を介して動物に埋め込まれた光ファイバーに接続されました。 GCaMP6f 蛍光はパッチコードを通して収集され、GFP 発光フィルター (MF525-39、Thorlabs) を通過し、光検出器 (LA1540-A、Thorlabs; Model 2151、Newport、Irvine、CA、USA) 上に集束されました。 次に、信号は 211 Hz に同期されたロックイン アンプ (時定数 30 ミリ秒、モデル SR830、Stanford Research Systems、カリフォルニア州サニーベール) に送信され、カスタム Matlab スクリプトと多機能データを使用して 1 KHz で収集されました。取得デバイス（National Instruments）。 GCaMP6f シグナルは、オペラント チャンバーから送信された TTL パルスを介してオペラント チャンバー内の動作と調整され、カスタム Matlab スクリプトを介して並列データ ストリームに記録されました。 GCaMP6f シグナルの変化を定量化するために、状態遷移前の値をベースラインとして平均し、ベースラインと GCaMP6f シグナル トレースの間の領域サイズ (ΔF/F 積分値) を求め、個々のマウスごとに平均しました。

Go/NoGo タスク全体で Hcrt ニューロンを刺激する効果を調べるために、Hcrt-cre+ マウスと Hcrt-cre- マウスを光ファイバーのパッチ コードを介してレーザーに接続しました。 光強度は、露出計 (Thorlabs) を使用して先端で 10 mW に校正されました。 次に、光ファイバーパッチコード (MFP_200/240/900-0.22_3.0m_FC-MF2.5、ドーリックレンズ) を、ジルコニアスリーブ (SLEEVE_ZR_2.50、ドーリックレンズ) を介してガラスファイバーインプラントに接続しました。 繊維の配置を検証するために、他の場所で報告されているように、持続的（30 秒以上）の睡眠様行動中に与えられた刺激（5 Hz で 5 秒、パルス幅 10 ms、10 mW）から 20 秒以内に動物が目覚める（動き始める）ことが確認されました57。 ,58。 固定されていない組織では組織の完全性が損なわれていたため、カニューレの解剖学的位置は別の動物グループで死後検証されました（補足図2を参照）。 光ファイバーを取り付けた Go/NoGo 装置に慣れた後、Go/NoGo トライアル中のさまざまな時点で、さまざまな周波数で光遺伝学的刺激を実行しました (ファイバー先端での光強度: 10 mW、光パルス幅: 15 ms、5 および 10 Hz) 5 秒間の刺激を実行しました）。 レーザー刺激の瞬間は、次の 4 つの試験条件間でランダムに配分されました。(1) レーザー刺激なし。 (2) PreCue 期間の最後の 5 秒間のレーザー刺激。 (3) Go Cue 期間の最初の 5 秒間のレーザー刺激。 (4) NoGo キュー期間の最初の 5 秒間のレーザー刺激。 光遺伝学的刺激パラメーターは、私たちの研究室から以前に報告された Hcrt 光遺伝学的刺激の検証に基づいて選択されました 18,56。

ChR2/GCaMP発現とヒポクレチン免疫反応性の共局在化のために、マウスにリン酸緩衝液、続いて緩衝化4%パラホルムアルデヒド(pH7.4)を経心臓的に灌流した。 次に、抽出した脳を 4% パラホルムアルデヒドで 2 時間後固定し、その後 30% スクロース溶液に入れて 48 時間凍結保護しました。 次いで、脳をライカクライオスタット上で３０μｍで切片化し、染色するまでリン酸緩衝液中に保存した。 スライスを、5%ウシ血清アルブミン/0.5%トリトン溶液中で36℃で1時間ブロックした。次いで、スライスを、3%BSA/0.3%トリトンで1:250希釈したヒポクレチン-Aに対する一次抗体(Abcam ab6214)中でインキュベートした。次にスライスをＰＢＳで洗浄し、続いて３％ＢＳＡ／０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ１００溶液中で１：１０００希釈したＡｌｅｘａＦｌｏｕｒ５９４とともに３６℃で１．５〜２時間インキュベートした。 次いで、スライスしたものをＰＢＳで洗浄し、次いでＤＡＰＩでマウントした。

すべての統計分析は、GraphPad Prism 8.4.1 を使用して完了しました。 ファイバー測光データは、統計因子として遷移タイプと時間 (遷移前と遷移後) を使用して、反復測定分散分析 (RM-ANOVA) によって分析されました。 試行応答間でサンプル サイズが異なるため、Precue-to-Cue 遷移からのファイバー測光データは混合効果モデルを使用して分析されました。 行動に対する Hcrt 光遺伝学的刺激頻度の影響は、刺激頻度と遺伝子型を統計的因子として使用した RM-ANOVA を使用して評価されました。 同様に、行動に対する薬物治療の効果は、遺伝子型と治療を因子としてRM-ANOVAを使用して分析されました。 ボンフェローニの多重比較検定は、特定のグループの違いを調査するために事後的に実行されました (補足データ 1)。 図のデータソース。 2 ～ 4 は補足データ 2 にあります。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

現在の研究中に生成および分析されたデータセットは、スタンフォードデジタルリポジトリ [https://purl.stanford.edu/sf095mv6553. https://doi.org/10.25740/sf095mv6553]。

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この研究は、ベーリンガーインゲルハイムと NIH からの助成金 (R01HL150566、R01MH116470、R01MH102638) によって資金提供され、LdLKJJ は NRSA ポスドクフェローシップ (F32HD095597) の受給者です。 SMT はフィリップ・ライトソン博士研究員フェローシップによって支援されました。

スーザン・M・タイリー

現在の住所: Atlantia Clinical Trials、アイルランド、コーク

キンバリー・J・ジェニングス

現在の住所: テキサス大学、米国テキサス州オースティン

米国カリフォルニア州スタンフォード、スタンフォード医学部精神医学・行動科学科

スーザン・M・タイリー、キンバリー・J・ジェニングス、オスカー・C・ゴンザレス、シビン・リー、ルイス・デ・レセア

Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG、ビーベラッハ、ドイツ

ジャネット・R・ニコルソン & モーリッツ・フォン・ハイメンダール

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JRN、MvH、LdL がこの作品を考案しました。 SMT はすべての行動実験、カルシウム記録、光遺伝学を実行し、データを分析しました。 KJJ はカルシウムの記録と分析を実施しました。 OCG と S.-BL は解剖学的カニューレの位置を確認し、免疫組織化学を実施しました。 JRN、MvH、LdLが監修しました。 LdL は、すべての著者からの意見をもとに原稿を書きました。

ルイス・デ・レセアへの通信。

JRN と MvH は、次のような競合する利益を宣言します: 彼らはベーリンガーインゲルハイムのフルタイム従業員です。 他のすべての著者は、競合する利益を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Karli Montague-Cardoso と George Inglis。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

タイリー、SM、ジェニングス、KJ、ゴンザレス、OC 他光遺伝学的および薬理学的介入は、マウスのヒポクレチンニューロンと衝動性を結びつけます。 Commun Biol 6、74 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04409-w

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受信日: 2021 年 2 月 26 日

受理日: 2023 年 1 月 3 日

公開日: 2023 年 1 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04409-w

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