コリン作動性の前脳基底核メイネルトが慢性疼痛を調節する

May 28, 2023

Nature Communications volume 13、記事番号: 5014 (2022) この記事を引用

3805 アクセス

10 オルトメトリック

メトリクスの詳細

メイナート基底核 (NBM) は、新皮質活動の深い調節を介して、注意、覚醒、認知において非常に重要な機能を果たしており、アルツハイマー病およびパーキンソン病の主要な標的として浮上しています。 しかし、痛みの知覚における新皮質ドメインの重要な役割にもかかわらず、NBM は慢性痛のモデルでは研究されていません。 今回我々は、行動するマウスの生体内四極管記録を用いて、NBMにおいて有害な刺激によってベータおよびガンマ振動活動が誘発され、炎症性疼痛様行動のピーク時に促進されることを報告する。 NBM コリン作動性 GABA 作動性ニューロンの光遺伝学的および化学遺伝学的細胞特異的可逆的操作により、侵害受容過敏性の内因性制御における NBM コリン作動性 GABA 作動性ニューロンの役割が明らかになり、侵害受容過敏症は前辺縁皮質への投射を介して現れ、第 5 層を介した抗侵害受容をもたらします。 私たちのデータは、痛みのような行動の新皮質処理のトップダウン制御における NBM の重要性を解明します。

慢性疼痛障害の適切な治療に対する主な障害は、痛みの知覚の基礎となる脳回路と、急性疼痛から慢性疼痛への移行における痛みの調節に関する不完全な知識によってもたらされます。 したがって、それらの解明は、治療の進歩だけでなく、メカニズムの洞察をもたらすためにも重要です。 脳回路の機能的調査に関する最近の研究は、痛みに関与する一部の脳ネットワークの構造機能特性に関する画期的な進歩につながり、特に新皮質ドメインの重要な役割を明らかにしました1。 痛みの知覚は、状況、環境、心理社会的要因によって大きく変化します。 神経機構に寄与するものとして、GABA作動性、ドーパミン作動性、およびセロトニン作動性経路からの求心性入力による新皮質処理の調節に関する洞察が得られつつある2。

それに比べて、痛みの知覚を調節する脳内のコリン作動性経路の範囲と機能についてはほとんどわかっていません。 これは、イオンチャネル性ニコチン性受容体と代謝指向性ムスカリン性受容体の両方を介したコリン作動性シグナル伝達が疼痛と鎮痛に及ぼす影響を報告した、過去 20 年間にわたる広範な薬理学的研究とは対照的です3。 コリン作動性リガンドの全身、末梢、および脊髄投与は侵害受容を調節し、中枢投与に関する研究は、コリン作動性シグナル伝達がオピオイド性鎮痛および下降性調節系に関与していることを示唆している。 しかし、主に基礎となる回路の理解、特にコリン作動性入力の起源の描写に関して大きなギャップがあるため、鎮痛に向けたコリン作動性調節の利用はほとんど進歩していない。 これは、促進効果と抑制効果の両方がコリン作動性受容体の薬理学的調節に関連しているため、特に重要です。これは、受容体を介したシグナル伝達の多様性だけでなく、神経系におけるコリン作動性調節の部位にも起因すると考えられます。

脳では、コリン作動性ニューロンは、尾状被殻などの特定の領域に局所介在ニューロンの形で豊富に存在するか、前脳基底部および脳幹のコリン作動性核 Ch1 ～ Ch6 に組織化されて、遠くの標的への投射ニューロンとして機能します4。 これらの中で、基底前脳系はコリン作動性細胞の個別のグループ (Ch1 ～ Ch4) で構成され、内側中隔 (MS) とブローカ対角帯の垂直肢 (vDB) のニューロンは主に海馬を標的とします。 Ch4 は主に新皮質マントルへのコリン作動性入力を占め、扁桃体 4 にも投射します。 げっ歯類の脳では、Ch4 に最も類似した構造は基底核大細胞核 (NBM; メイネルト基底核) によって与えられ、これも前交連の腹側にある無名実体と呼ばれる帯にまで伸びており、これらはまとめて総称されます。この研究ではNBMという用語を使用しており、他のいくつかの発表された研究と一致しています（たとえば、参考文献5、図1aの概略図）。 この部門には、前脳基底部からの皮質弁突起の最大の構成要素が含まれており、本質的に圧倒的にコリン作動性です。 NBM は、覚醒、注意、恐怖、社会的認識記憶を含む社会的相互作用など、特定の重要な機能において調節的な役割を果たしていると考えられています5。 さらに、NBM は、錐体ニューロンと GABA 作動性介在ニューロンの両方が関与するニコチン性およびムスカリン性メカニズムを介して皮質回路の「信号対ノイズ」比を高めることにより、感覚処理の鋭敏性を高めることに関与していると考えられています6,7。 痛みにおける新皮質処理の重要性を考慮すると、これらの特性により、NBM は痛みの知覚とその可塑性を調節する重要な位置に置かれる可能性があります 1。 しかし、驚くべきことに、興奮毒性病変やコリン作動性グループの広範な毒素媒介アブレーションに関するいくつかの研究を除いて、NBM は痛みに関連してほとんど研究されていません。 重要なことは、基礎となるネイティブ回路を機能的に描写した研究が存在しないことです。 さらに、NBM の活動パターンが痛みに関連して変化するかどうか、また生体内で慢性痛への移行中に NBM が可塑性を示すかどうか、またどのように変化するかは依然として不明のままです。

a マウス脳の主要なコリン作動性核の概略図 (b、c) NBM コリン作動性ニューロン (ChAT + ve、矢印: 共標識細胞) におけるカプサイシン誘発性の Fos 免疫組織化学の増加の典型的な例 (a) および定量化 (b)。 n = 3 匹のマウス/グループ。 P < 0.05 (*0.0103、#0.0263)、Sidak の多重比較検定による二元配置分散分析。 d 後足のフォン・フライ機械的刺激に応答したNBM（白い矢印：断面の電極先端損傷）における生体内四極管記録の概略図（参考文献31から出典）。 e 弱いフィラメント（0.07 gおよび0.16 g;）または強いフィラメント（0.6 gおよび1 g）のいずれかに対する足引っ込め反応を伴うすべての試験のNBMにおけるスペクトル変調の平均時間-周波数表現。 f、g 周波数範囲シータ (4 ～ 8 Hz)、アルファ (8 ～ 14 Hz)、ベータ (14 ～ 30 Hz)、およびガンマ (30 ～ 100 Hz) における振動活動のパワー (f) の対応する定量化。次のように表されます。刺激適用前の1秒のベースライン活動に対する適用後の2秒間の変化の%、および対応する時間経過(g)。 青い縦線: 足を引っ込める時間。 e、gでは、n = 5のマウス。 *P < 0.05; f では 1 サンプル t 検定 (両側) を使用しました。 さまざまなグループの t 値と P 値は次のとおりです。 弱いフィラメント: t = 2.06、1.89、3.10、2.60。 P = 0.108、0.132、0.036、0.060; 強力なフィラメント: t = 2.50、2.57、3.07、3.81。 P = 0.067、0.062、0.037、0.019; それぞれシータ、アルファ、ベータ、ガンマ。 ダネットの多重比較対刺激前ベースラインによる一元配置反復測定分散分析を g 単位で採用しました (*P = 0.0058, 0.0007, 0.0143, 0.0048, 0.0021, 0.0019, 0.0106, 0.0013, 0.0005, 0.0007, 0.000) 1、0.0028、0.0013、ベータの場合は 0.0006、0.0011、0.0148、0.0091、0.0002、0.0045、0.0012、0.0001、0.0022、0.0036、0.0016、0.0005、0.0012、0.0451、0.001ガンマパワー時間ビンの場合は左から右にそれぞれ 5、0.0124、0.0197）。 スケールバーは、b では 0.5 mm と 50 μm (右)、d では 250 μm を表します。 MS内側中隔核、vDBブローカ対角帯、LDT後背側被蓋核、PPT足橋被蓋核、mPFC内側前頭前皮質、AC前交連、CPu尾状被殻、GP淡蒼球、LOT外側嗅覚路核、MFB内側前脳束、IC 内部カプセル、ERP イベント関連の電位または摂動。 データは平均値 +/- 平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。

ここでは、四極管を使用して生体内記録を実行し、侵害受容および炎症性過敏症への移行中の自由に動き、行動するマウスのNBMの単一ニューロンの活動および振動場のリズムの変化を動的に捕捉しました。 我々は、痛みを誘発する（有害な）刺激に対するNBMの特異的な反応を報告する。これは、炎症性疼痛モデルにおける低強度の刺激に対する反応性の切り替えを示し、行動過敏症を反映している。 同時に、ガンマお​​よびベータ振動リズムはスペクトルパワーの増強を受けます。 我々は、可逆的な細胞型特異的な化学遺伝学的操作と光遺伝学的な操作を行動と組み合わせて使用​​し、NBMにおけるコリン作動性活性の増強と前頭前皮質へのその投射が、炎症性疼痛と神経障害性疼痛の両方の状態における侵害受容性過敏症を抑制し、その結果、これらのコリン作動性細胞群を特に標的とする治療戦略。

野生型マウスの足底内カプサイシンの後肢注射は、強い強直性の痛みを急性に誘発し、NBMにおける活性依存性の前初期遺伝子産物であるFosの発現の大幅な増加をもたらしました（図1aに概略的に示されています）。これには、マーカーコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT;図1b）の同時標識によって見られるコリン作動性ニューロンが含まれます。 次に、覚醒して行動するマウスの電気生理学実験でこの領域をターゲットにし、四極管を使用して場の電位と単一細胞の両方のレベルでNBM活性の変化を直接研究しました。 von Frey フィラメントを介した機械的力の適用は、ベースライン（刺激前）の活動レベルを超えるすべての周波数帯域にわたる活動の増加と関連していました（図1d、e。補足図1aも参照）。 複数の試験および動物にわたって、侵害受容閾値以上の刺激（フォン・フレイ力0.6～1.0 g）および低強度の刺激を加えた場合、ベータ振動（14～30 Hz）のパワーの増加が統計的に有意でした。 、非有害な触覚刺激（0.07〜0.16 g）に対して、ガンマ振動（30〜100 Hz）のパワーは侵害受容強度刺激とともに選択的に増加しました（図1f）。 皮質領域のガンマ振動はヒトとげっ歯類の研究の両方で侵害受容と機能的に関連しており 8,9,10 、GABA作動性介在ニューロンを介した活動の同期と関連していることが知られているため、この発見は特に興味深い。 有害な機械的刺激によって誘発されるベータ活性およびガンマ活性の増加は、行動的侵害防御反応の前に統計的に有意なレベルに達し、刺激の適用後2秒間維持されました（図1g、比較のために、非有害刺激のデータは次のとおりです）補足図2bに示されています）。

我々は次に、持続性炎症性疼痛に特徴的な侵害受容から過敏症への進行におけるNBMの潜在的な重要性を試験しようとした。 実際、完全フロイントアジュバント（CFA）の注射によって誘発された片側後肢炎症を有するマウスは、侵害受容性過敏症を示し（補足図1c）、NBMのコリン作動性ニューロンにおけるFos発現の亢進を示しました（図2a、b）。 次に、ナイーブな状態とCFA誘発性過敏症が確立された後の振動活動を比較しました。 後足へのCFA注射の24時間後、これは機械的刺激に対する行動の過敏性が手のピークに達する時間に相当しますが、足の刺激により、ベータおよびガンマリズムのパワーが大幅に増加しました（図2c、d） ）、NBMのアルファおよびシータ活性はありません（補足図1d）。 興味深い発見は、炎症性疼痛に関連したガンマおよびベータパワーの増加が、低強度の機械的刺激で見られたことであり、これは通常、生理学的状態では有害ではありませんが、炎症状態では有害として認識されます（図2e）。 総合すると、これらの発見は、NBMが侵害受容中に補充され、炎症性疼痛様行動における過敏症への移行に対するNBMの反応性の促進を示すことを示しています。

a、b ベースライン条件下またはCFA注射後1日における、対側足底後足への0.16 gの力による機械的刺激の適用の有無におけるNBMのコリン作動性ニューロンの活性の比較。 代表的な例 (a) と定量化 (b) を示します。 n = 4 匹のマウス/グループ。 P < 0.05 (*0.0005、#0.0134)、Sidak の多重比較検定による二元配置分散分析。 c CFA注射後1日目のマウスのNBMのスペクトルパワーの時間周波数表現（n = 5マウス/治療）。 d、e ナイーブ（偽）条件とCFA 1日目の間のベータおよびガンマ周波数範囲における振動活動のパワーの比較。刺激適用前の1秒のベースライン活動に対する適用後2秒間の増加％として計算されます。 無害なフィラメント（0.07および0.16 g）および有害な機械的圧力（0.6〜1.0 g）に応答した刺激応答曲線（d）またはスペクトルパワーの%変化の分析（e）が示されています。 n = 5 匹のマウス/グループ。 *P < 0.05 (d では 0.07 g で 0.0417、0.16 g では 0.0244、e ではベータ弱で 0.0425 & ガンマ弱で 0.0095)、Sidak の多重比較検定による二元配置分散分析。 データは平均 +/- SEM として表示されます。

スパイクソーティングによる単一細胞レベルでの活性の分析により、痛みにおけるNBMの応答性と可塑性の細胞の性質について興味深い洞察が得られました。 ナイーブな条件下で記録された 221 単位のうち、弱いフィラメントまたは強いフィラメントで 20 回の機械的足刺激を適用した際の離脱試験で発火率の一貫した増加または減少を示したのは 10% 未満でした (図 3a、b)。 トレースの例と平均 Z スコア (平均を上回るまたは下回るデータ ポイントの標準偏差の数を示す) を図 3a に、単位比率を図 3b に示します。 炎症性疼痛様行動を示すマウスでは、機械的刺激に反応するユニットの割合は、CFA注射後最初の4日間の強い過敏症の間、大きく変化しませんでした（図3bおよび補足図2a）。 ただし、この期間にわたって、Z スコアの最大値は、有害な強度の機械的刺激によって興奮したニューロンでは大幅に増加しましたが (図 3c)、機械的刺激によって抑制されたニューロンでは増加しませんでした (補足図 2b)。 LFPレベルで観察された振動活動のパワー。 さらに、スパイク波形の形状を分析することにより、ユニットを広いスパイク波形または狭いスパイク波形を持つクラス 1 (図 3d) とクラス 2 (図 3e) に分類しました。 GABA作動性投射ニューロンおよび介在ニューロンの高速スパイククラスは、クラス2ユニット内に表されます13。 興味深いことに、足の炎症を伴うマウスでは、対照マウスと比較して、クラス2ニューロンのみが感覚刺激に応答して統計的に有意な活性の増加を示しました（図3d、e）。 これらのデータは、機械的刺激によって興奮する NBM ニューロンが炎症性侵害受容過敏症の発現に対して促進を受けていること、さらに NBM の高速スパイクのクラス 2 GABA 作動性ニューロンが特にこれらの変化に寄与していることを示唆しています。 マウス NBM では、ChAT を発現するコリン作動性ニューロンの 92% が GABAergic であることが知られているため、この発見は注目に値します。 CFA注射後の遅い時点（7〜14日）で、正常な侵害受容感受性が回復した後、NBMの振動および単一細胞活動のパターンが正常化するだけでなく、部分的にベースライン値を下回ることさえ観察しました（補足図）。 2b および 3a、b)。

a 典型的な例 (上のパネル) と、平均を上回るまたは下回るデータ ポイントの標準偏差の数を表す平均 Z スコア。足の有害な刺激によって興奮する NBM ユニット (左端のパネル)、足の刺激によって活動が抑制されたユニット（中央のパネル）と、足の刺激後に活動が大幅に変化しなかったユニット。 b ナイーブ（偽）条件および後足のCFA誘発ピーク炎症性疼痛様行動中（1〜4日目）の機械的刺激に応答するNBMユニットの分布。 c – e 機械的刺激によって興奮したユニットの平均ベースライン値を超える活性の最大の増強が、ナイーブマウスおよびCFA後のマウスで実証されています。 d、e で​​は、ユニットは波形に基づいてクラス 1 (d) とクラス 2 (高速スパイク、e) タイプのニューロンに再分割されます。 n = 5 匹のマウス/グループ。 *P < 0.05 (c で 0.0412、e で 0.0191)、Sidak の多重比較検定 (c) および対応のない両側 t 検定 (d、e) を使用した二元配置分散分析。 データは平均 +/- SEM として表示されます。

私たちの発見の重要性を直接明らかにするために、青色光依存性カチオンチャネルチャネルロドプシンをChAT発現ニューロンに標的化することにより、細胞特異的な光遺伝学的アプローチを採用しました。 組換えアデノ随伴ビリオン（AAV）を定位注射して、ChAT-CreトランスジェニックマウスのNBMにCre依存的に黄色蛍光タンパク質タグ付きチャネルロドプシン（rAAV-Dio-ChR2-YFP）を片側的に発現させました（図4a、b） ）。 同じ治療を受けたCre陰性マウスを対照として使用した。 慢性的に移植された光ファイバーを介してNBMに青色光を送達すると、コリン作動性ニューロンにおけるFos発現が大幅に増加し、それによってこのアプローチの生体内検証が確立されました（図4c、d）。 青色光刺激では、機械的刺激に対するベースラインの感度は変化しませんでした（図4e、ベースライン）。 しかし、炎症性過敏症の発現を表すフォン・フライ刺激反応関数の左方向および上方向へのシフトは、CFA後2日目のピーク感作で試験した場合、Cre-対照と比較してCre+マウスで有意に低下した。 (図4e、中央パネル)。 同様に、機械的離脱閾値は、Cre+の青色光刺激によりCFAマウスで有意に増加しましたが、対照Cre-マウスでは増加しませんでした（図4f）。 全体として、ベースライン値を超える機械的過敏症の大きさは減少し、NBMコリン作動性ニューロンの光遺伝学的刺激によりベースライン感度への復帰がより速くなりました（図4f）。 しかし、CFA誘発性の熱性痛覚過敏は、大きさや持続時間において有意な変化はありませんでした（図4g）。

青色レーザー光を用いてNBMコリン作動性ニューロンを光遺伝学的に操作するためのスキーム。 b – d NBMにおける興奮性オプシン、チャネルロドプシン-EYFPの発現（b）、青色光によるEYFP+およびChAT+ニューロンにおけるFos発現の増強の典型的な例（c）および定量化（d）（cの矢印）。インビボでの光遺伝学的活性化の有効性。 n = 3 匹のマウス/グループ。 *P < 0.05 (0.0234、上; 0.0183、下)、対応のない両側 t 検定。 スケールバー = b では 200 μm、c では 25 μm。 e、f 足底内CFA注射によって誘発されたピーク機械的過敏症（2日目）の大幅な軽減。フォン・フライ刺激に応答した刺激反応曲線（e）および離脱閾値（f）として示されています。 挿入図の P 値は、2 つの刺激応答曲線全体の ANOVA ベースの比較を表します。 g ヒートランプに対する過敏症の調節の欠如。 e、fn = 7 ChAT-Cre- マウスおよび 8 ChAT-Cre+ マウス。 P < 0.05 (*0.0275、e の中央; *0.0139、#0.0231、f の中央)、Sidak の多重比較検定による二元配置分散分析。 データは平均 +/- SEM として表示されます。

NBM は多数の新皮質標的に投射し、その多くは痛みや過敏症にさまざまな形で影響を与えるため、我々は次に、脳の重要なハブである内側前頭前皮質 (mPFC) への NBM ニューロン投射の重要性を詳しく分析しようとしました。痛みの根底にある回路。 mPFC は、いくつかのヒト臨床慢性疼痛状態において顕著な可塑性を示し、特に一部の慢性疼痛患者で観察される mPFC の不活性化に大きな焦点が当てられており 15、この発見は神経因性疼痛の動物モデルでも報告されている 16、17、18、19。 したがって、NBMのChATニューロンでChR2-YFPを発現させ、ヒトmPFCのマウス対応物である前辺縁皮質（PL）に青色光照明用の光ファイバーを配置しました（図5a）。 PLへのNBMコリン作動性投射を選択的に活性化すると、ベースラインの機械的過敏症には影響しませんでしたが、CFA誘発性の機械的過敏症に対してNBMニューロンの直接活性化よりもさらに強い鎮痛効果があり、ベースライン値に完全に逆転しました（図5b）。 さらに、NBM-PL投影の光遺伝学的刺激により、マウスのCFA後の熱過敏症は長期間にわたって有意に抑制されました（図5c）。

a – c NBM-PLコリン作動性-GABA作動性投影を光遺伝学的に刺激するためのスキーム、および炎症機械的（2日目; b）および熱過敏症（c）に対するその影響。 挿入図 (b) の P 値は、2 つの刺激応答曲線全体の ANOVA ベースの比較を表します。 n = 6 ChAT-Cre- マウスおよび 11 ChAT-Cre+ マウス。 P < 0.05 (*0.0043、b の右パネル; (c) の CFA 3 日目および 8 日目について *,# < 0.0001)、Sidak の多重比較検定による二元配置分散分析。 d ニコチン性およびムスカリン性コリン作動性シグナル伝達を介してPL錐体ニューロンの発火に影響を与える、NBMコリン作動性-GABA作動性投射、興奮性求心性神経および多様なPLニューロンの間の接続スキーム。 IN GABA作動性介在ニューロン、PN錐体ニューロン。 GABA作動性介在ニューロンの種類：PVパルブアルブミンタイプ、SOMソマトスタチンタイプ、VIP血管作動性腸管ペプチドタイプ。 e PL（右への拡大）および隣接する皮質へのNBM投影を示す抗YFP免疫組織化学の画像例（左：縫い合わせられた異なる高解像度共焦点視野）。 スケール バー = 250 μm (左) および 100 μm (右)。 f – h NBM-PLコリン作動性-GABA作動性の光遺伝学的刺激に応答した、すべてのPL層または層5（f）、興奮性投射ニューロン（SATB2またはCtip2; g）および抑制性ニューロン（PVまたはSOM; h）のFos定量化。投影（Cre+ マウスで表す）または対照（Cre- マウスで表す）（すべてのマウスは「レーザー ON」）。 パネル f ～ h では N = 5 匹のマウス/グループ。 *P < 0.05 (すべての層: 0.0091、Sham、<0.0001、CFA、層 5: 0.0036、Sham、<0.0001、CFA)、二元配置分散分析に続いて f について事後シダック検定、および対応のない両側 t 検定gの場合（P = 0.0166、SATB2の場合、およびCtip2の場合は0.0066）およびh。 CFAを注射したマウスのみをg、hで表す。 i Cre依存的に興奮性DREADD、hm3D(Gq)を発現するRbp4-Creマウスに​​おける炎症性機械的過敏症。 n = 8 マウス/グループ; *P < 0.05 (0.07、0.16、および 0.4 g フィラメントの場合はそれぞれ 0.0019、0.0019、0.0002)、Sidak の多重比較検定による二元配置分散分析。 データは平均 +/- SEM として表示されます。

電気生理学的研究およびモデリング研究により、前脳基底部からのコリン作動性入力は、受容体媒介シグナル伝達を介して皮質錐体ニューロンに直接興奮効果を及ぼし、また、局所新皮質GABA作動性介在ニューロンまたは局所の異なるクラスのシグナル伝達を介して錐体ニューロンの抑制または脱抑制を引き起こす能力があることが示されています。さまざまな種類のニコチン性およびムスカリン性受容体を介したシグナル伝達を介して。 興味深いことに、最近の研究では、GABAが前脳基底核に由来するコリン作動性投射から同時放出され、局所抑制性介在ニューロンを抑制することによって新皮質錐体ニューロンを脱抑制できることも示しています14,21（図5dの概略図）。 両方のメカニズムは、感覚入力、たとえば視覚野の視覚入力や体性感覚皮質の触覚入力の皮質の信号対雑音処理を強化する方向に作用すると示唆されています21。 NBM-PL コリン作動性 - GABA 作動性投影が PL にどのような影響を与えるかに対処するために、光遺伝学と組み合わせて、ウイルス追跡と層全体の c-Fos マッピングを実行しました。 興味深いことに、新皮質マントルの大部分へのNBM投影はすべての皮質層に拡散的に広がっていますが、追跡分析により、NBMからPLへの投影は、他の層と比較して特に豊富な方法で第5層で終了することが明らかになりました（図5e;隣接する層と比較）運動皮質 M2 および帯状皮質ドメイン)。 ベースライン状態（ナイーブマウス）と炎症性疼痛様行動を示すマウスの両方において、NBM-PL投影の光遺伝学的刺激により、層2/3、層5、層6を含むPL全体のFosレベルの有意な増加が引き起こされました（図1）。図５ｆおよび補足図４ａ；すべてのデータ点は「レーザーＯＮ」状態を表す）。 Fosを発現するPLニューロンは、すべてのマウスにおいてベースラインレベルと比較して、足の炎症時に増加しました。 ただし、ChR2発現マウスの光遺伝学的にNBM-PL接続を活性化すると、CFAを注射したマウスのFos発現PLニューロンの数が、炎症によって誘発される増加を超えて増加しました（図5fおよび補足図4a;すべてのデータポイントは「レーザー」を表します） 「ON」条件）。 次に、終脳内から他の新皮質領域に投射する連合ニューロンに相対的な優先性を示す興奮性ニューロンを標識する抗 SATB2 抗体と標識する抗 Ctip2 抗体を使用して、CFA 注射マウスの Fos+ ニューロンの性質の詳細な特性評価を実行しました。皮質下に突出する興奮性ニューロン23、およびGABA作動性ニューロンの最も豊富な2つの集団を標識するための抗パルブアルブミンおよび抗ソマトスタチン抗体11。 NBM-PL投影の光遺伝学的刺激は、興奮性投影ニューロンのSATB2およびCtip2集団の両方でFos活性化を促進しますが（図5g）、PLのGABA作動性ニューロンの活性は変化しないことを観察しました（図5h）。 最近の研究では、PL の主要な出力は、水道周囲灰白質に投射し、それによって下行性侵害受容調節システムにリンクする PL の第 5 層錐体ニューロンで構成されていることが示されています 24。 したがって、我々は、第5層特異的Rbp4-Cre株におけるhM3D(Gq)発現25をウイルス的に指示することによって、第5層ニューロンを化学遺伝学的に選択的に刺激し、PLにおける第5層出力の選択的増強が、機械的異痛症に対するNBM-PL刺激の抗痛覚過敏作用を模倣することを観察した。 CFAを有するマウスでは、ベースラインの感受性は変化しなかった(図5i、左パネル; mCherry発現を対照として使用した、図5i、右パネル)。

翻訳関連性の観点から、NBM コリン作動性系を標的とすることが他の形態の痛み、特に神経因性疼痛にも有益であるかどうかを検討することが重要です。 したがって、我々は、ベースライン条件下では無害である低強度の機械的フォン・フレイ力の足底適用の非存在下またはその際のFos発現を研究することにより、コリン作動性NBMシステムが神経因性疼痛状態で動員され、機械的異痛症に関連しているかどうかを検討した。 NBMにおけるFos発現は、偽損傷マウスと比較して神経障害マウスで有意に上昇し、機械的異痛症に関連する足刺激によりさらなる増加を示した（図6a、b）。 重要なことに、これはChATを発現するコリン作動性ニューロンにも反映されており（図6a、b）、これはベースライン状態では無害であるが、神経因性疼痛状態では有害であると認識される刺激による動員の増加を示唆しており、したがって電気生理学的実験での我々の発見との類似性を示しています。上述の炎症性疼痛モデルにおいて。

a、b 低強度（ 0.16 g) 対側後肢での機械的刺激。 スケールバー = 50 μm。 n = 4 匹のマウス/グループ。 P < 0.05 (*0.0168、#0.0065)、Sidak の多重比較検定による二元配置分散分析。 c、d hm3D（Gq）を発現するNBMコリン作動性ニューロンをクロザピンN-オキシド（CNO; c）で化学遺伝学的に活性化するスキーム、およびコリン作動性ニューロンでmCherryを発現するマウス（コントロール; d）と比較したFos発現の増加におけるその有効性の検証。 dn = 3 匹のマウス/グループ。 e – g NBMコリン作動性ニューロンの化学遺伝学的活性化を有するマウスと対照（mCherry）マウス間の、カプサイシン誘発性侵害防御反応（e）とCCI誘発性機械過敏症（f）または熱過敏症（g）の発症の比較。 挿入図（f）の P 値は、2 つの刺激応答曲線全体の ANOVA ベースの比較を表します。 n = 5 匹の偽マウスと 6 匹の hM3D(Gq) マウス。 *P < 0.05 (0.0121 in e; 0.0178 & 0.0231、CCI 7日目; 0.0151 & 0.0165、CCI 11日目; 0.0209 CCI 28日目 in f; <0.0001、CCI 4日目; 0.010、CCI 14日目 (g)、2- Sidak の多重比較検定を使用した ANOVA の方法。 データは平均 +/- SEM として表示されます。

神経因性疼痛の状態との関連でこれらの発見の機能的重要性をテストするために、前脳基底部のコリン作動性ニューロンを活性化する化学遺伝学的アプローチを採用しました。これにより、2 つの利点が得られました。1 つは、光遺伝学的刺激（制限されている）よりも広い領域をターゲットにすることができることです。十分に照射できる最大面積のため）、第二に、コリン作動性ニューロンのより長時間にわたる活性化を達成することが可能になりました。 ChAT-Cre トランスジェニックに、Cre 依存的に興奮性化学遺伝学的アクチュエーター (mcherry タグ付き hM3D(Gq)) またはコントロール (mCherry) タンパク質のいずれかを発現する rAAV を注入し、hM3D の誘導的活性化を可能にするクロザピン N-オキシドで処理しました( Gq)25 (図 6c)。 ChATおよびFosの二重免疫組織化学により、NBMのコリン作動性ニューロンの77％がhM3D（Gq）を発現し、74％がCNO処理時にFos発現を示した一方、CNOの非存在下でFos発現を示したのは5％未満であったことが実証されました（図6d）。これにより、NBM コリン作動性ニューロンの化学遺伝学的活性化の有効性と特異性が検証されます。 光遺伝学実験のデータと一致して、機械的圧力と熱に対するベースラインの侵害受容感受性は変化しないことが観察されました。 ただし、カプシアシンの足底注射によって誘発される強直性疼痛様行動は、コリン作動性ニューロンの化学遺伝学的活性化により大幅に減少しました（図6e-g）。

次に、我々は、片側の坐骨神経の緩い結紮を伴う慢性狭窄損傷（CCI）モデルを採用しました。これにより、局所的な炎症と神経の腫れ、神経障害、侵害受容過敏症が最大 1 か月間持続します 26。 CCI誘発性の機械的過敏症は、CCI手術後4日目からmCherry発現マウスと比較してhM3D(Gq)発現マウスで顕著に減少した(図6f)。 11日目では、hM3D（Gq）発現マウスの機械的反応はベースラインの感受性と区別できませんでしたが、mCherry発現マウスは引き続き機械的過敏症を示し、28日目にのみベースライン値を回復しました（図6f）。 同様に、熱過敏症は、CCI後14日目まで、mCherry発現マウスと比較してhM3D(Gq)発現マウスで有意に減少した(図6g)。 これらのデータは、NBM の活性化が長期間にわたって神経障害性過敏症を抑制することを示しています。

NBM ニューロンの活動は、前頭前層 5 ニューロンに関する上記の観察によって示されているように、疼痛ネットワークにおいて重要な新皮質標的におけるコリン作動性シグナル伝達を介して疼痛処理に直接影響を与える可能性があります。 しかし、NBM は覚醒と注意の基礎となる回路の重要な調節因子であることが知られているため 20、観察された抗痛覚過敏効果が注意と期待に関連している可能性もあります。 したがって、実験で侵害受容テストに使用されたマウスで実施されたのと同じ条件下で、広く受け入れられている5選択肢の連続反応課題テスト（5-CSRT;図7a）を使用して、NBMコリン作動性ニューロンの光遺伝学的刺激が注意行動に影響を与えるかどうかにも取り組みました。図１〜３に記載されている。 4～6。 3週間にわたって、水を制限されたマウスは、水の報酬を受け取るための正しい決定を下すためのオペラント条件付けタスクで学習するように訓練されました（図7a）。 NBM コリン作動性ニューロンの化学遺伝学的刺激は、反応の精度を大幅に向上させ、省略の割合を減少させ、注意レベルが高いことを示しました (図 7b)。 ただし、痛みのような行動の分析に使用されたのと同じ条件下でNBM-PL投影を光遺伝学的に刺激した場合、反応の精度と省略率に大きな影響はありませんでした（図7cおよび補足図5a、 b）これは、抗痛覚過敏行動の発現自体が注意力の変化に関連していないことを示唆しています。 ただし、NBM-PL 投影に関連する実験では、ベースライン条件下でのシーリング効果により注意力の潜在的な改善が見逃された可能性があり、注意力の低下に伴う痛みの状態では状況が異なる可能性があります。 したがって、本発明者らは、炎症性疼痛様行動を有するマウスを5-CSRT試験で試験し、すべてのマウスが、ベースライン条件と比較して、CFA後3日までの省略率の有意な増加を示すことを観察した（図7d）。 ただし、これらのマウスのNBM-PL投影を光遺伝学的に活性化しても、持続的な痛みに関連した注意欠陥は救済されず（図7dおよび補足図5c）、レーザー刺激がオンになっているかどうかに関係なく、CFA誘発性の障害は維持されました（図7d）。 ChAT-CreまたはCre陰性対照マウスの両方でまたはオフ（補足図5c）、したがって、NBM-PL投影が注意の調節とは独立して鎮痛を誘発することをさらに示唆しています。

a 5 選択連続反応タスク テスト (5-CSRT) における注意関連タスクでマウスを訓練するスキーム。 b、c NBMのコリン作動性ニューロンの化学遺伝学的活性化を伴うマウスでは注意関連パラメータが増加しましたが（b）、PLへのNBMコリン作動性投射の光遺伝学的活性化を伴うマウスでは増加しません（c）。 n = 10 匹のマウス/グループ (b); n = 6 ChAT-Cre- マウスおよび 8 ChAT-Cre+ マウス (c)。 *P < 0.05 (省略試行、0.0259; 精度、0.0008)、対応のある両側 t 検定。 d ChAT-Cre+マウスおよびCre-対照マウスにおけるNBM-PLコリン作動性投射の青色光刺激の存在下でのベースライン行動と比較した、後足CFA注射後の炎症性疼痛様行動の誘発時の注意行動の変化。 N = 9 ChAT-Cre- マウスおよび 10 ChAT-Cre+ マウス。 *P < 0.05 (Cre-、0.0068; Cre+、<0.0001)、Sidak の多重比較検定による二元配置分散分析。 e – g コリン作動性の化学遺伝学的 (e) または光遺伝学的 (f) 活性化を持つマウスのオープンフィールド試験における不安関連行動 (e、f、g の上) および運動 (e、f、g の下) の分析PLへのNBMコリン作動性投射の光遺伝学的活性化を伴うNBMまたはマウスのニューロン（g）を、それぞれの対照群と比較した。 n = 6 mCherry マウスおよび 8 hm3D(Gq) マウス (e); n = 7 ChAT-Cre- マウスおよび 8 ChAT-Cre+ マウス (f); n = 6 匹のマウス/グループ (g); *P < 0.05 (g 単位の不安スコアについては 0.0182)、Sidak の多重比較検定による二元配置分散分析。 データは平均 +/- SEM として表示されます。

第二に、NBM は CeA から直接入力を受け取り、不安と恐怖の神経回路にリンクされています 27。 オープンフィールドテストでは、NBMニューロンの直接的な化学遺伝的刺激（図7e）も光遺伝学的刺激（図7f）も恐怖に関連した行動を誘発しないことが観察されました（中心と縁の比は変化しませんでした）。 対照的に、光遺伝学的に刺激したNBM-PL投影は、ナイーブマウスの中心対縁の比を減少させ、抗不安効果を示唆しました（図7g）。 最後に、移動運動は、NBMまたはNBM-PL回路の光遺伝学的または化学遺伝学的調節を含むすべてのグループで変化せず、行動分析における運動機能に対する交絡効果の欠如を示唆しています（図7e-g）。

前脳基底部コリン作動性核と痛みの知覚に関する文献は驚くほど少ない。 現在までに、有害な刺激に対する前脳基底部コリン作動性核の活性をテストした研究は数えるほどしかありません。 この研究では、NBM の振動リズムの正確な性質と生体内での単細胞レベルでの詳細な分析を報告し、NBM が有害な刺激に反応するだけでなく、移行中に動的変化を受けることを示しています。慢性的な痛みのような状態になります。 最も興味深い観察は、NBM におけるガンマ振動活動の力が、行動反応の前に有害な刺激と関連して特に強化されるということでした。 S1 のガンマ振動は、生体内でヒトとげっ歯類の両方の系における侵害受容調節と機能的に関連しており 30,31、これらの痛みに関連したガンマ活性の変化が、前頭前野や島皮質などの他の新皮質にも拡張されたのはつい最近のことです 9,32 、33。 この研究は、我々の知る限りでは、皮質下構造のガンマリズムと侵害受容感受性を関連づけた最初の報告である。 これらは、頭皮記録の技術的な制限により、人間の研究では見逃されている可能性があります。

重要なのは、炎症性疼痛モデルにおいて、非有害な触覚刺激に応答してガンマ活性の力が増強されるという我々の観察は、機械的異痛症の発現と相関しており、S1皮質で行われた同様の観察を模倣していることである31。 現在の知識と併せて考えると、我々の発見の興味深い含意は、NBMにおけるガンマ活性が、コリン作動性経路を介して侵害受容処理中の新皮質ガンマ振動と機能的に関連しているということである。 これは、いくつかの概念的な点と実験的観察によって裏付けられています。 まず、ラットを使った最近の研究では、有害刺激後のNBMの血流力学的変化が報告されており、有害刺激によって引き起こされる同側S1皮質の脳血流変化がNBM34に損傷を与えると有意に減少することが実証されており、したがって、NBMの重要性が示唆されています34。体性感覚皮質における疼痛関連反応の完全な発現。 第二に、S1 と前頭前皮質の両方において、コリン作動性シグナル伝達は、局所 GABA 作動性介在ニューロンの調節を介してガンマ帯域振動活動を促進、または直接誘発することさえあり 35,36、それによって感覚および注意ネットワークにおける刺激処理の鋭敏性を高めますが、これらの現象はまだ解明されていません。これまで痛みの文脈で取り上げられてきました。 さらに、ガンマ振動活動は、脳内の離れた部位にまたがる活動状態を調整し、リンクさせると提案されている。これは、痛みは本質的にネットワーク機能であるため、痛みの文脈において特に注目すべき概念である8。

ガンマ振動活動の出現における顕著な役割は、ギャップ結合を介して広範囲に相互接続されている高速スパイク GABA 作動性介在ニューロンに起因すると考えられています。 それらは、領域内の興奮性出力を効率化して同期させるだけでなく、長距離の GABA 作動性投射を介して離れた部位でもそうすることができ、通常は GABA 作動性ニューロン上でシナプスを形成し、それによって脱抑制につながります 8,11。 重要なことは、ここで我々は、異なるセットのNBMニューロンが侵害受容刺激時に興奮または抑制を示す一方、侵害受容過敏症への移行中に顕著な変化を受けるNBMニューロンは、波形解析から高速スパイクGABA作動性ニューロンであることが判明したことを観察した。 NBM では、コリン作動性ニューロンの圧倒的多数が GABA 作動性であり 11、これらは新皮質外套膜への長距離投射を構成しているため、NBM におけるガンマ振動活動の起源と皮質による疼痛の調節との関連にさらなる信憑性が与えられています。 また、振動活動のベータ周波数範囲の変化も観察されました。 しかし、その細胞起源や痛みに対する機能的重要性についてはほとんど知られていません。 健康な被験者を対象とした研究では、低周波帯域、特にアルファおよびベータ範囲の活動が、主観的な痛みの評価と相関して、S1、前頭前野および島皮質で抑制されることが報告されています9,39。 痛みの状態におけるNBMのベータリズム変化の重要性と、これが新皮質のベータ振動の変化に寄与するかどうか、またどのように寄与するかを解明するには、さらなる研究が必要となるだろう。

活性誘導性の即時初期遺伝子産物である Fos を用いた我々の分析は、NBM のコリン作動性ニューロンが炎症性および神経因性疼痛状態において、特に感覚刺激と関連してますます動員されることを示唆しています。 この発見と、上で論じた NBM コリン作動性ニューロンの全体的な機能プロファイルは、侵害促進性または抗侵害受容性のいずれかの調節における NBM の役割を同様に十分に主張する可能性があります。 ここで、NBM コリン作動性ニューロンの 2 つの独立した活性化モードにより、それらの活性化の最終結果は侵害受容性過敏症を抑制することであることが明らかになりました。 脳室内注射を介して投与された結合型サポリンを用いたコリン作動性ニューロンへの大規模な損傷に関する以前の研究では、脊髄侵害防御行動に変化はなく、有害な熱とストレスの多い音の両方からの自発的逃避が減少したと報告されており、感覚行動ではなく影響は調節されると結論づけている。前脳コリン作動性ニューロン40; しかし、それらの結論は、脳全体の広範な切除、実質の毒性、海馬、扁桃体、皮質を含む多くの領域への接続の喪失に基づいていました。 ここで、NBMに限定されたニューロンの完全性ではなく、細胞特異的で可逆的な活動操作は、NBMコリン作動性ニューロンの動員が、知覚される痛みを制限する上で全体的な保護的役割を担っていることを示唆している。 NBM ニューロンは扁桃体だけでなく、機能の異なる多様な新皮質領域に投射するため、個々の接続が異なる役割を果たしている可能性を排除することはできません。 これらの方針に沿って、別のコリン作動性核、すなわち内側中隔核を扱った最近の研究では、阻害と活性化の両方が逆説的に、吻側前帯状皮質と腹側海馬CA1に対する相反する効果によって疼痛様行動の抑制につながることを報告した。地域41。 ここでは、PL皮質へのNBM投射を特異的に活性化することにより、抗侵害受容機能についての明確な根拠が得られ、これには、第5層への求心性投射のより密な標的化と、PLの第5層錐体ニューロンにおけるFos発現の増強の観察が伴った。 さらなる裏付けとして、我々は、光遺伝学的刺激を介した第5層PLニューロンの出力の増強が、NBM-PL接続の刺激と同様の抗侵害受容結果をもたらすという証拠を提供する。 我々のデータは、炎症性疼痛様状態においてPLが活性の増加を示すことを示しており、これは炎症性疼痛におけるNBMの振動活性の亢進と一致している。 重要なことに、PL 興奮性ニューロンの活性は、NBM-PL 経路の活性化によってさらに強化されますが、抑制性ニューロンの活性は強化されません。 PL の不活性化が、ある種の慢性疼痛患者 15,19 およびげっ歯類の神経因性疼痛モデル 16,17,18,19 で報告されているため、この特性は臨床関連性を保持している可能性があります。 神経障害性疼痛モデルでは、光遺伝学的に 24,42、薬理学的に 43、または非侵襲性経頭蓋脳刺激 44 によって PL 出力を高めると、鎮痛が誘発されることが実証されています。 実際、慢性疼痛における前頭前皮質の不活性化の根底にあるメカニズムは、現在非常に関心が集まっているテーマであり、神経障害性疼痛における高速スパイクGABA作動性ニューロンへの扁桃体入力の増強によるフィードフォワード阻害の強化が実証されている研究がある17,24。 対照的に、GABAを同時放出することが知られているNBMから入ってくるコリン作動性求心性神経は、それぞれ直接調節と局所GABA作動性ニューロンの調節を介して新皮質錐体ニューロンを阻害または脱阻害する能力を持っています。 今回の我々の結果は、NBMのPLへのコリン作動性-GABA作動性投射が、興奮性投射ニューロンの活性化の増加を介してPL活性を増強する働きをし、これが神経因性疼痛状態におけるPLの非活性化に対抗するのに役立つ可能性があることを示している。 これを裏付けるものとして、神経障害性マウスのPLの第5層ニューロンにおける興奮性M1ムスカリン受容体のシナプス発現の減少を示すex vivo研究と、前部マウスにM1-M4アゴニストを適用した場合の神経障害性異痛症の抑制を報告する研究からの証拠がある。帯状皮質46． 将来の研究では、例えば薬理学的アゴニストおよびアンタゴニストの局所送達を介してPLの活性を調節する際の、NBM-PL求心性神経から同時に放出されるGABAおよびアセチルコリンの相対的な寄与を分析することが興味深いであろう。

NBM はさまざまな異なる機能を担っているため、別の解釈で推論を調整することが重要です。 注意力の調節は、NBM20の最もよく研​​究されている機能の1つであり、NBMコリン作動性神経細胞体に光遺伝学的刺激を直接受けたマウスを用いたこの研究で実際に確認された。 注意は、例えば、下降変調を変更することによって、またはハイパービジランズによる痛みの知覚の増強に関して、痛みの知覚を大きく調節することが示唆されており、注意因子がNBMによる痛みの調節に役割を果たしている可能性がある。 しかし、PLへのNBMコリン作動性投射の選択的活性化は、注意と動機を調節するには不十分であり、したがって侵害防御行動の変化を完全に説明できる可能性は低い。 代わりに、コリン作動性-GABA作動性NBM求心性入力による第5層PLニューロンの活性化の強化により、第5層錐体ニューロンのPAG18,24への既知の直接接続が侵害受容の下降性変調をもたらすという説がより尤もらしくなるであろう。 運動活動または全体的な活動は変化しておらず、観察された鎮痛効果が覚醒および運動機能障害とは無関係であることを示唆しています。 NBM-PL 投影を刺激したときに観察される潜在的な抗不安効果は、病的疼痛の併存症としての恐怖に対処する上で特に有望である可能性があるため、興味深いものです 49。

総合すると、この研究の結果は、疼痛治療におけるコリン作動性調節の利用に関するさらなる研究を裏付けるものである。 コリン作動性受容体を標的とする薬剤は前臨床モデルで有効性を示すことが実証されているが、広範囲にわたる副作用が臨床応用を妨げている。 リバスチグミンやネオスチグミンなどのアセチルコリンエステラーゼの阻害剤は、この神経伝達物質が生理学的に放出される部位での生物学的利用能を高め、痛みに関する多くの研究で臨床効果を示しています3,50。 したがって、副作用を少なくしながら有益な効果が最も期待できる慢性疼痛における作用部位と回路の変化を明らかにすることが不可欠です。 この研究は、最先端の生体内電気生理学と特定の回路操作を使用して、NBMが痛みの知覚に関与する回路の重要なモジュレーターであり、神経刺激技術の新しい設計を介してNBMの活性またはPFCへのその投影を直接強化することを実証しています。炎症性および神経因性疼痛障害の治療に期待されています。 これらの方針に沿って、NBM が全身麻酔薬の潜在的な作用部位として既に関与していることは注目に値します 51。

NBM を標的にすることは、この研究では取り上げられなかった慢性疼痛の他の側面においても治療の可能性を秘めている可能性があります。 たとえば、慢性疼痛状態には睡眠障害が伴うことが多く、予後や治療反応を悪化させる病原性があります52,53。 睡眠不足は、前頭前皮質への NBM の接続性の低下につながることが示されています 54。 さらに、アルツハイマー病やパーキンソン病などの疾患や加齢による NBM のニューロン喪失が報告されています 55,56,57,58。 この研究の結果は、NBMにおける神経細胞の枯渇が中枢性抗侵害受容調節効果の喪失につながる可能性が高く、それによってこれらの状態に頻繁に関連する疼痛障害の一因となる可能性があることを示唆している。 足の炎症後の非常に後期段階での NBM 活性の低下に関する我々の観察も、この点で興味深いものです。 したがって、NBM の脳深部刺激の進行中の開発とテストは、認知機能の低下を軽減するだけでなく、これらの疾患における痛みを抑制し、通常の睡眠を回復することを期待しています。

実験は、C57BL/6 バックグラウンドを持つ生後 2 ～ 8 か月の雄と雌のヘテロ接合型 Chat-IRES-Cre マウス (B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl//Uhg59;) で行われ、ここでは ChAT-Cre と呼ばれます。ネズミ。 Cre-(陰性)同腹子を対照実験に使用した。 C57BL/6 バックグラウンドを持つ生後 2 ～ 4 か月の雄と雌の Rbp4-Cre 動物 (B6.FVB/CD1-Tg(Rbp4cre)KL100Gsat/Uhg) を、前辺縁皮質の第 5 層錐体ニューロンを標的とする化学遺伝学的検査に使用しました。 生後 8 ～ 20 週齢の C57BL/6J 雄および雌の動物を Janvier Labs から購入しました。 動物には、12時間の明/12時間の暗サイクルで食物と水を自由に与えて飼育した。 ARRIVE ガイドラインに従いました。 すべての実験手順は、地方自治体 (Regierungspräsidium Karlsruhe、ドイツ、承認番号 35-9185.81/G44/17 および 35-9185.81/G184/18) によって設定された倫理ガイドラインに従って実行されました。

フェンタニル（０．０１ｍｇ／ｋｇ）、塩酸メデトミジン（０．３ｍｇ／ｋｇ）、ミダゾラム（４ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によりマウスを深く麻酔した。 リドカイン (10%) を皮膚の表面に塗布し、対象領域の上に小さな穴を開けました。 組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV) の in vivo 送達は、定位注射によって実行されました。 ブレグマに対して使用した NBM 座標は、軟膜から 4.55 mm の深さで後方 0.35 mm、側方 1.6 mm でした。 rAAV2-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP (ノースカロライナ大学ベクターコア、米国) ウイルス (250 nl) は希釈せずに 20 分間かけて送達されましたが、rAAV5-Syn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry および rAAV5-Syn -DIO-mCherry (Addgene Inc.、米国) ウイルス溶液を PBS で 1:1 に希釈し、400 nl を 20 分間かけて注入しました。 動物は、行動実験および電気生理学的実験の前に、最適な生体内ウイルス発現を達成するために少なくとも 3 週間飼育されました。

光遺伝学的実験では、慢性光ファイバーインプラント（コア直径200μm、開口数（NA）0.5）を、NBMのウイルス注射部位の100μm上、または15度の側方回転を使用してPL皮質の両側に挿入しました。 °（ブレグマから前方 1.94 mm、側方 0.9 mm、軟膜から 1.5 mm の深さ）、歯科用セメントとネジで頭蓋骨に固定します。 全身麻酔は、ナロキソン (Inresa Arzneimittel、ドイツ、フライブルク、0.4 mg/kg)、フルマゼニル (Fresenius、バート ホンブルク、ドイツ、0.5 mg/kg)、およびアティパメゾール (Prodivet Pharmaceuticals、ベルギー、2.5 mg/kg) の腹腔内投与で拮抗されました。 。

電気生理学的実験では、2 本のステンレス鋼ネジを小脳と右感覚皮質の上の頭蓋骨に埋め込み、それぞれ接地電極と参照電極として機能させました。 次に、左前脳基底部の上に頭蓋窓を準備しました (AP = -0.35 mm、ML = 0.9 mm)。 硬膜を除去し、4 つの独立して駆動可能な四極管 (タングステン、直径 12 μm、カリフォルニア ファイン ワイヤー) で構成される versadrive-4 (Neuralynx) を、左前脳基底部に初期深さ 4.3 mm で移植しました。 頭蓋窓を骨ワックスで覆い、versadrive-4 セットアップを歯科用セメントで頭蓋骨に固定しました。

慢性狭窄損傷（CCI26）の場合、マウスをイソフルラン麻酔（2%）下に置き、右大腿部の毛を剃りました。 大腿部の外側皮膚表面と大腿二頭筋を貫通して切開を行い、そのすぐ上の坐骨神経を露出させ、腓腹神経、総腓骨神経、および脛骨神経に分岐させた。 猫の腸の外科用縫合糸を使用して坐骨神経の周囲に4本の緩い結紮を配置し、続いて筋肉と皮膚を縫合して閉じ、動物を加熱ケージ内で24時間放置して回復させた。 術後２日目から行動検査を開始した。 坐骨神経結紮を行わずに同じ手術を偽対照動物に実施した。

光パッチケーブル（1×2波長分割光ファイバロータリージョイントに接続された0.5 NAデュアルファイバ、Doric Lenses Inc.、カナダ）を光ファイバインプラントに取り付けるために、マウスを柔らかい綿布にしっかりと拘束した。 光ファイバーロータリージョイントは、光パッチコード (コア直径 200 µm、Thorlabs GmbH) を介して 473 nm レーザー (Shanghai Laser & Optics Century Co. Ltd、中国) に接続されました。 レーザー強度は、光度計 (PM100D、Thorlabs) を使用してファイバー先端で測定して 4 mW に設定されました。 パルスレーザー光（20 Hz、パルス幅10 ms）は、通常、機械的刺激または熱刺激イベントの15～20秒前、または5-CSRTテストの各試験開始イベントとともに開始して、30秒間適用されました。パルス発生器（カタログ番号 33220 A、Meilhaus Electronic GmbH、ドイツ）。

行動試験は、動物の明周期中に実施されました。 動物は、機械的または熱的感受性をテストするために使用されるセットアップチャンバー内で 2 回の順応セッションを受けました。 ベースライン感受性は、CCI手術を実施する前、または短時間のイソフルラン麻酔下で25μlの完全フロイントアジュバント（CFA、Sigma-Aldrich）の足底皮下注射によって足の炎症を誘発する前に、3回のテストセッションで数日間評価されました。 hM3D(Gq) を発現する動物と対応する mCherry 対照を含む行動試験を、生理食塩水またはクロザピン N-オキシド (CNO、2 mg/kg 腹腔内注射; Biomol、ドイツ) のいずれかを注射して 1 時間後に実施しました。 実験者は常に治療グループの正体について知らされていませんでした。

カプサイシン (Sigma) を、凍結ジメチルスルホキシド (DMSO、Thermo Fisher Scientific) 原液 (50 倍) からリン酸緩衝生理食塩水 (PBS、Thermo Fisher Scientific) で希釈して、2 中に 0.02% (重量/体積) のカプサイシン濃度を得ました。 %DMSO。 動物を２％イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ、ドイツ）で短時間麻酔し、２０μＬのカプサイシン溶液を３０Ｇ針を用いて後足の足底表面に皮下注射した。 次に、動物をアクリルガラス板上の透明な箱（20×20cm）に入れ、動物が侵害防御行動（足を上げる、なめる、ひるむ、もがく）を示した合計時間を実験者が5分間にわたって評価しました。治療状況が分からない。

von Frey セットアップ (Ugo Basile Inc.、イタリア) に順応させた後、0.04 g、0.07 g、0.16 g、0.4 g、0.6 g、1.0 g、および 1.4 g の力で曲げる一連のモノフィラメントを垂直に適用しました。後足の足底面。 フィラメントあたり 5 回の塗布を、各塗布間に最小 1 分の間隔をあけて塗布しました。 光遺伝学的刺激実験では、フィラメントを適用する 20 秒前にレーザーをオンにし、機械的刺激を適用した後 10 秒後にレーザーをオフにしました。 各動物のテストセッション中に、フィラメントごとおよびレーザー状態ごとに合計 5 回のアプリケーションが適用されました。 機械的刺激中またはフィラメントの除去直後に、動物が足を素早く引っ込める、なめる、または足を振るなどの侵害反応行動を示した場合、試験は陽性と判定されました。 足を引っ込める閾値は、Dixon のアップダウン法 60 を使用して決定されました。

赤外線熱源 (モデル 37370-001、Ugo Basile) を備えた Hargreaves 足底試験セットアップ (Ugo Basile Inc.、イタリア) を使用して、後足の足底表面に輻射熱を加えることによって熱離脱閾値を試験しました。 強度レベルは 25、カットオフタイムは 30 秒に設定されました。 熱刺激は覚醒段階中にのみ適用され、刺激開始からの離脱潜時が記録されました。 試験日の治療条件および動物ごとに 6 回の試験を、最小試験間隔 2 分を使用して実施しました。 光遺伝学 Hargreaves テストセッション中に、レーザー ON トライアルとレーザー OFF トライアルがランダムに散在しました。 熱刺激を開始する 20 秒前にレーザーをオンにし、足を引っ込める反応の 5 秒後にスイッチを切りました。

オープンフィールド試験は、動物の動きのパターンを追跡し、ANY迷路ソフトウェア（Stoelting Co. 、アイルランド）。 動物たちはこの設定に慣れていなかったため、探索すべき新たな領域に遭遇しました。 ボックスは分析のために 3 つのゾーンに分割されました。 箱の壁に沿った幅 3 cm の境界を接触走性ゾーンとして定義しました。 ボックスの幾何学的中心にある 20 × 20 cm の正方形ゾーンを中心ゾーンとして定義しました。 残りの領域をマージンゾーンとして定義した。 各マウスを箱の中央に置き、フィールド全体を 8 分間自由に探索させました。 8 分間のテストを 30 秒の期間に分割し、各マウスが全体で 4 分間の照明を受けるように、レーザーをランダムにオンとオフを交互に切り替えました。 テスト中、各セグメント内の移動パラメータ (距離と平均速度) が記録されました。 不安様行動を評価するために、中心部と走性ゾーンで過ごした時間の比が使用されました。 運動機能は、3 つのゾーンすべてで移動した合計距離から評価されました。

コリン作動性 NBM ニューロンおよび 6 匹および 9 匹の Cre-ve コントロールにおいて hM3(Gq) DRADD (n = 10) または ChR2(H134R) オプシン (n = 8 および n = 10) を発現する ChAT-Cre マウスの 3 コホート光遺伝学的試験グループの動物は、自動Bussey-Saksidaマウスタッチスクリーンオペラントチャンバー（Campden Instruments、ラフバラー、英国）およびABET II TOUCHソフトウェア（Lafayette Instrument、インディアナ州）を使用して、5選択連続反応時間（5-CSRT）タスクで訓練されました。 、米国）。 訓練および試験の段階を通じて、動物は飲料水へのアクセスが制限されていたため（1日あたり30分）、課題中の個々の試験で正しい選択行動を強化するためのご褒美として水を使用することができました。 慣れとトレーニングについては、Humby61 および ABET II TOUCH 5-CSRT タスク モジュール (バージョン 3) で概説されている手順に従いました。 簡単に言うと、所定の期間、5 つのウィンドウのうちの 1 つに光の合図が提示され、合図が消えた後 5 秒以内に動物が合図ウィンドウのモニターに触れた場合、試行は正解としてカウントされました。 マウスが別のウィンドウと対話した場合 (不正確な試行)、またはキュー提示後にタッチ スクリーンの対話が検出されなかった場合 (省略試行) は、家の照明が 5 秒間点灯することで罰則タイムアウト期間が通知されました。 セッションは 60 回の試行で構成され、マウスは 1 日あたり 1 セッションを実行しました。 各ステージのパフォーマンスが 80% を超える精度 [正しい試行回数 / 応答した試行総数 (正解 + 不正解)] および <20% の省略 [失敗した回数] の基準に達するまで、キューの継続時間は 30 秒から 1.4 秒に連続的に短縮されました。試行数/提示された試行数] を 2 日連続で表示します。 DREADD 動物は、生理食塩水または CNO 注射を受けた後、1.2 秒の合図期間を使用して 5 日間にわたって 3 回テストされました。 テスト日間のメンテナンスセッションでは、キュー提示期間が 0.2 秒延長されました。

光遺伝学コホートの後期トレーニング段階では、すでにレーザーをオンにすることなく、光パッチコードが毎日接続されていました。 1.8 秒間表示された合図でパフォーマンス基準に達したら、1.6 秒の合図提示期間を使用して動物をテストし、各試行の開始時にレーザーをオンにし、水報酬の収集後、または 5 秒延長した直後にレーザーをオフにしました。正しいタッチ応答が検出されなかった場合の時間枠。 レーザーをオンにするかどうかのテストによってベースラインを確立した後、ChAT-Cre+ (n = 10) および Cre- (n = 9) マウスのコホートに 20 μl CFA の足底皮下注射を行いました (上記の行動テストのセクションを参照) ）、その後、半ランダムな順序でレーザーをオンまたはオフにして隔日にテストされました。 ベースライン期間中に 30% を超える省略試験を行った動物は除外されました。

実験の最後に、マウスを二酸化炭素の過剰摂取で屠殺し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、続いて10％ホルマリン（Merck、ドイツ）を経心的に灌流した。 脳を収集し、さらに 4 °C で 24 時間後固定しました。 脳切片をビブラトームで厚さ 50 μm に切断し、Mowiol でマウントし、蛍光顕微鏡で画像化して、Cre+ 動物の電極部位または AAV 注射の位置を確認しました。

急性および炎症性疼痛様症状におけるコリン作動性ニューロン活動の変化を評価するために、後足へのカプサイシン注射、炎症を起こした足の反復的な機械的刺激（0.16 g フィラメント、10 分間で 20 秒間隔）の後に動物を 90 分間灌流しました。 CFA 2 日目、および 4 日目に CCI および偽動物の同側の足に。 光遺伝学的刺激によって誘発されるニューロン活動を評価するために、Cre+ および Cre- 動物の 10 分間にパルスレーザー光を 30 秒間 5 回点灯し、90 分後に灌流しました。 同様に、CNO または生理食塩水を DREADD 動物に灌流の 2 時間前に注射しました。

抗 Fos (ウサギ; ab190289、Abcam、英国) および抗 ChAT (ヤギ; AB144P、Merck) による二重免疫標識を、それぞれ 1:1000 および 1:250 で使用しました。 簡単に説明すると、切片をPBS/50 mM グリシン中で10分間インキュベートし、続いてPBS中の0.2% Tritonを含む4% ウマ血清中で60分間のブロッキングステップを行った。 切片を両方の一次抗体とともにブロッキング溶液中で 4 °C で 24 時間インキュベートしました。 続いて、切片をブロッキング溶液で洗浄し（10分間の洗浄を3回）、ロバ抗ウサギAlexa-488およびロバ抗ヤギAlexa-633の二次抗体混合物（Invitrogen、米国、それぞれ1：700）とともにインキュベートしました。ブロッキング溶液を室温で 2 時間処理します。 ロバ抗ウサギ Alexa-594 は、AAV 誘導性 EYFP 発現のある脳に使用されました。 AAV 形質導入 NBM 末端の EYFP 蛍光を増強するために、前頭脳切片のサブセットをウサギ抗 Fos (1:1000) とニワトリ抗 GFP (ab13970、Abcam; 1:1000、最初にプレインキュベート) のカクテルで免疫標識しました。ナイーブ C57bl6 マウスの脳切片を使用した 1:100 希釈で 4 °C で 72 時間）一次抗体（4 °C で 48 時間インキュベート）、ロバ抗ウサギ Alexa-594 およびヤギ抗ニワトリ Alexa-488 を使用(Invitrogen、米国; 各 1:700) 二次抗体 (上記と同様、室温で 2 時間インキュベート)。 組織を PBS で 2 回洗浄し、Hoechst 33342 (10 mg/ml ストック溶液から PBS で 1:10,000 に希釈、Invitrogen) で 10 分間インキュベートし、PBS で再度洗浄し、さらに 10 mM TRIS-HCl で 10 分間インキュベートしてから、取り付け。

さらに、ウサギ抗 Fos (Abcam、1:1000)、ラット抗ソマトスタチン (EMD Millipore、1:300)、およびモルモット抗パルブアルブミン (Swant、1:500) を使用して、2 セットの三重免疫組織化学標識実験を実施しました。 ）、またはウサギ抗Fos（Abcam、1：1000）、ラット抗Ctip2（Abcam、1：500）、およびモルモット抗SATB2（Synaptic Systems、1：200）。 二重免疫染色手順について上記のように切片を処理し、4℃で48時間インキュベートしました。 使用した二次抗体は、ロバ抗ウサギ IgG Alexa-488、ロバ抗ラット IgG Alexa-594、およびヤギ抗モルモット IgG Alexa 647 (すべて Invitrogen、1:700) でした。 抗体染色の特異性は、一次抗体を省略してテストされました。

切片は、ピクセル解像度 1024 × 1024 のレーザー走査型共焦点顕微鏡 (Leica TCS SP8、ドイツ) を使用して画像化されました。照明パラメーターは、すべての動物の画像シリーズで同一に保たれました。 Fos標識切片のイメージングにはドライエア対物レンズ（ライカ、10×/0.40、HC PL APO）を使用し、三重標識切片のイメージングには補正環付き液浸対物レンズ（ライカ、20×/0.75、HC PL APO）を使用しました。 共焦点画像スタックのモンタージュは、各セクションの中間レベルの関心領域を中心とした深さ 25 μm で取得され、画像の最大 Z 投影が ImageJ ソフトウェア (バージョン 1.50b、国立研究所) でのカウントに適用されました。米国保健省）。 マウス脳定位アトラス 62 と Allan Institut (2011) の参照アトラスをそれぞれ使用して、対応する参照セクションに従って関心領域と皮質層の輪郭を定義しました。 実験グループ内のすべてのセクションに対して同じコントラストと閾値設定を使用して、各関心領域内の Fos 標識、二重および三重標識細胞を手動でカウントしました。 境界上にある陽性細胞は除外した。 細胞数は、対象領域内の画像化されたスタック ボリューム内の陽性細胞の数 (細胞/mm3) を示すように変換されました。

対象領域 (サイズが中外側 1.5 mm × 背腹側 1.0 mm) を、ChAT+ または EYFP+ ニューロンの発現が最も高い NBM 領域上のカウント フレームとして使用しました。 淡蒼球の下端を上部境界として使用した。 実験グループ内のすべてのセクションに対して同じコントラストと閾値設定を使用して、両半球の計数フレーム内の Fos+ 二重および三重標識細胞を手動で計数しました。 カプサイシン治療グループの二重標識 Fos+ ニューロンの数は、各半球における ChAT+ ニューロンの％として表される 3 つの脳切片の平均です。 他のすべての治療グループでは、二重および三重標識された Fos+ ニューロンの数が半球間で有意な差がなかったため、2 つの半球からのデータを各脳スライスで平均し、画像化されたスタック ボリューム内の陽性細胞の数を示すように変換されました。対象領域内 (セル/mm3)。

移植手術から回復して 1 週間後、四極管は対象領域内に平均 0.5 mm 下げられ、実験が終了するまで変更されませんでした。 マウスをフォン・フライ試験記録設定の高いグリッドに２日間慣れさせた。 単純な機械的感度テストを、弱いフィラメント (0.07 g および 0.6 g) および強いフィラメント (0.6 g および 1.0 g) を使用して 4 日間実行しました。 各フィラメントを右後足の足底表面に、刺激試行間の最小 60 秒間隔で 10 回適用しました。 CFA溶液(25μl、完全フロイントアジュバント、Sigma)を右後足の足底側に皮下注射することによって慢性炎症を誘発した。 機械的侵害受容試験は、ベースライン試験に使用したものと同じフィラメントを用いて、CFA注射後1、2、3、4、7、9、12、14日目に実施した。 行動実験の最後に、マウスを2%イソフルランで深く麻酔し、小さな損傷を誘発するために電流を流して各四極管先端の位置を標識し、動物を経心臓的に灌流して脳組織を固定した。

神経信号は、Digital Lynx 4SX システムおよびチーター データ取得ソフトウェア (Neuralynx) を使用して、HS-18-MM ヘッドステージを介して取得されました。 生データは、バンドパス フィルター (1 ～ 6000 Hz) を使用して 32 kHz で取得されました。 フォン・フライ刺激は、フォン・フライ刺激の圧力を 1 ～ 2000 Hz でバンドパス フィルター処理されたアナログ信号に変換するカスタムメイドの圧電トランスデューサー (ピエゾ セラミック素子、部品番号 717770、Conrad) によって記録されました 31。 さらに、機械的刺激イベントのビデオが USB カメラ (20 フレーム/秒) で記録され、キーボードで生成されたイベント信号を介して圧電信号と同期されました。 刺激の開始は、ビデオおよび圧電記録をそれぞれ視覚的に検査することによって、圧電信号の初期偏向に対応するフォン・フライ・フィラメントと後足との接触時間として定義された。

局所電場電位 (LFP) と単一ユニットの活動は、MATLAB63 (The Mathworks Inc、バージョン R2014a) を使用してカスタム作成されたスクリプトで分析されました。 統計分析と事後テストは、Graphpad Prism (バージョン 9) で実行されました。

LFP 活性のスペクトログラム分析のために、離脱試験のための von Frey フィラメント適用の開始の 3 秒前と 3 秒後が生データから抽出されました。 動物ごとに四極管の 1 つのチャネルを分析しました。 生データ エピソードは、通過帯域のリップルが 0.5 dB、通過帯域エッジ周波数が 200 Hz の 3 次ローパス チェビシェフ I 型フィルターでフィルター処理され、1000 Hz までダウンサンプリングされました。 パワー スペクトログラムは、中心周波数を 0.8125 Hz、周波数精度を 0.5 Hz、時間分解能を 1 ms に設定して、Morlet ウェーブレット関数を使用して生成されました。 刺激開始前の 1 秒のベースライン期間を使用して、各 0.5 Hz 周波数セグメントをそれぞれの平均で正規化し、刺激前のベースラインからの偏差 (%) として表しました。 次に、個々の試験の正規化されたパワー スペクトログラムを、各マウスおよび各日の弱いフィラメントと強いフィラメントについて平均しました。 すべての動物についてのこれらの正規化されたスペクトログラムの総平均を図1および2に示します。 1e、2c、および補足図3a。

定量分析では、パワー スペクトログラムのシータ (4 ～ 8 Hz)、アルファ (8 ～ 14 Hz)、ベータ (14 ～ 30 Hz)、およびガンマ (30 ～ 100 Hz) を含む 4 つの周波数帯域の平均を使用します。各動物は、刺激後 2 秒の期間全体にわたって計算されました。 時間経過分析では、各動物の正規化されたスペクトログラムを 100 ミリ秒のビンに分割し、周波数帯域ごとに平均を計算しました。 スペクトログラムの対応するトライアルの離脱時間の中央値が参考として計算されました。 個々のフィラメントの力をスペクトログラムのパワーの増加と相関させるために、刺激後 2 秒にわたる正規化されたパワーを各フィラメントおよび各動物の周波数帯域について平均しました。

Kilosort264 を使用してスパイクソーティングを実行し、単一ユニットを分離しました。 生データは、300 ～ 6000 Hz のバンドパス フィルターで前処理されました。 テンプレートマッチング手法に基づいてドリフト補正、ユニットクラスタリング、テンプレートマッチングを自動で実行しました。 自動的にクラスター化されたユニットは、波形の類似性、クラスター機能、発火率、相互相関機能と自己相関機能を使用して、Phy (バージョン 2.0; https://github.com/cortex-lab/phy) で手動でキュレーションされました。

単一ユニットデータにおける誘発活動の変化を分析するために、各離脱トライアルの発火活動を、すべてのフィラメントの離脱トライアル、または弱いフィラメントグループと強いフィラメントグループごとに個別に離脱トライアルの刺激開始に合わせて調整しました。 試行全体の発火率は 250 ms ビンで計算され、Z スコアは 3 秒間の刺激前ベースライン活動の平均と標準偏差に基づいて計算されました 44。 刺激後 3 秒間の正規化ビンの少なくとも 1 つがそれぞれ 3.09 または -3.09 を超えた場合、活性の有意な増加または減少を示すユニットが特定されました。これは、P < 0.001 の有意水準に相当します。 それ以外の場合、ユニットは応答しないユニットとして分類されました。 平均発火率が 1 Hz 未満、または離脱試行回数が 3 回未満の場合、ユニットはこの分析から除外されました。刺激誘発反応の大きさを比較するために、すべてのユニットの最大および最小 Z スコアが抽出されました。それぞれ、刺激後 3 秒以内に発火率が大幅に増加または減少しました。

単一ユニットの分類では、発火率、スパイク間間隔の変動係数、波形のピーク間振幅、初期波形ピークと後期波形ピークの間の時間、波形の谷から波形に戻るまでの時間など、さまざまなパラメータが計算されました。ベースラインおよび波形の非対称性（ベースラインから初期ピークまでの時間と、ベースラインからのピークに戻るまでの後期時間の差の商、これら 2 つの時間の合計）。 これらの多次元パラメータは、t-SNE (t 分布確率的近傍埋め込み) Matlab 関数 65 を使用して 2 次元に投影されました。 次に、k-means アルゴリズムを適用して、これらのユニットを 2 つのクラスターにクラスター化しました。 クラスター分離に基づいて、非対称パラメーターと谷からベースラインに戻るまでの時間という 2 つの波形パラメーターのみを使用して、最適なユニット分類が達成されました。 私たちは、分類したユニットが興奮性ニューロンであるか抑制性ニューロンであるかを区別しようとはしませんでした。また、投射ニューロンと介在ニューロンを区別することもできません。

すべてのデータは平均値 ± SEM として表されます。 特に明記しない限り。 Prism (バージョン 9) は、すべての行動データの統計分析と、電気生理学的データセットの事後比較テストの実行に使用されました。 1 サンプル t 検定を実行して、離脱試験の LFP パワー スペクトログラムの特定の周波数帯域が刺激前のベースラインから大きく逸脱しているかどうかを検出しました。 Q = 0.5% の ROUT 法を使用して外れ値をテストしました。 図1gと補足図1bの時間経過分析には、刺激前のベースラインとの差についてのダネットの多重比較検定を使用した反復測定一元配置分散分析が使用されました。 グループ化されたすべてのデータセットは、有意なメイングループ効果をもたらした関連治療の組み合わせを多重比較するためのシダック検定を使用した二元配置分散分析で分析されました。 対応のないスチューデントの t 検定を使用して、対照群と比較した治療効果を試験しました。 単位応答タイプのカイ二乗偶発性検定 (補足図 2b) は、逸脱したデータセットを検出するために、すべての期間に適用されるだけでなく、ペアごとの期間の組み合わせにも適用されました。 すべてのテストにおいて、<0.05 の P 値が有意であるとみなされました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究で生成された電気生理学データは、アクセッション コード [https://doi.org/10.11588/data/ET9G9X] で heiDATA リポジトリに保管されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

電気生理学的データを分析するための Matlab スクリプトは、生データとともに同じリポジトリ [https://doi.org/10.11588/data/ET9G9X] で入手できます。

Tan, LL & Kuner, R. 痛みと鎮痛における新皮質回路。 ナット。 神経科学牧師。 22、458–471 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kuner, R. & Kuner, T. 脳内の細胞回路と急性および慢性疼痛におけるその調節。 生理。 改訂 101、213–258 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Naser, PV & Kuner, R. コリン作動性疼痛調節の分子、細胞および回路基盤。 神経科学 387、135–148 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mesulam, MM、Mufson, EJ、Wainer, BH & Levey, AI ラットの中枢コリン作動性経路: 代替命名法 (Ch1-Ch6) に基づく概要。 神経科学 10、1185–1201 (1983)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

岡田和也ほか前脳基底部のさまざまなコリン作動性細胞グループが、社会的相互作用と社会的認識記憶を制御します。 科学。 議員 11、13589 (2021)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chaves-Coira, I.、Rodrigo-Angulo, ML、Nunez, A. 前脳基底部から感覚皮質への両側性経路は、同期感覚処理に寄与している可能性があります。 フロント。 ニューロアナト。 12、5 (2018)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Fang, Y.-Y.、ヤマグチ, T.、Song, SC、Tritsch, NX & Lin, D. 母親の行動を促進するために不可欠な視床下部の中脳経路。 ニューロン 98、192–207.e110 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tan, LL、Oswald, MJ & Kuner, R. 急性および慢性疼痛における脳振動の神経生物学。 トレンド神経科学。 44、629–642 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ploner, M.、Sorg, C.、Gross, J. 痛みの脳リズム。 トレンド認知度科学。 21、100–110 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Yue, L.、Iannetti, GD & Hu, L. 侵害受容誘発ガンマバンド振動の神経起源。 J. Neurosci. 40、3478–3490 (2020)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Melzer, S. & Monyer, H. 皮質弁および皮質遠性 GABA 作動性投射ニューロンの多様性と機能。 ナット。 神経科学牧師。 21、499–515 (2020)。

Bartho, P. et al. ネットワーク相互作用と細胞外特徴による新皮質主要細胞と介在ニューロンの特性評価。 J. Neurophysiol. 92、600–608 (2004)。

論文 PubMed Google Scholar

Yague, JG、Tsunematsu, T.、Sakata, S. 前脳基底部と聴覚皮質間の自発集団活動の独特な時間的調整。 フロント。 神経回路 11、64 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Saunders, A.、Granger, AJ & Sabatini, BL コリン作動性前脳ニューロンからのアセチルコリンと GABA のコア放出。 eLife 4、e06412 (2015)。

アプカリアン、AV 他。 慢性腰痛は、前頭前部および視床の灰白質密度の減少に関連しています。 J. Neurosci. 24、10410–10415 (2004)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ji、G.ら。 扁桃体による前頭前皮質の不活性化による痛みの認知障害。 J. Neurosci. 30、5451–5464 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang、Z.ら。 神経因性疼痛の感覚および感情面における辺縁前部のGABA作動性回路の役割。 Cell Rep. 12、752–759 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Cheriyan, J. & Sheets, PL 神経因性疼痛のマウスモデルにおける mPFC-PAG ニューロンの興奮性と局所的接続性の変化。 J. Neurosci. 38、4829–4839 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jefferson, T.、Kelly, CJ & Martina, M. 慢性疼痛モデルにおける内側前頭前皮質への興奮性入力の差次的再配置。 フロント。 神経回路 15、791043 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ザボルスキー、L.ら。 特定の前脳基底皮質コリン作動性回路が認知動作を調整します。 J. Neurosci. 38、9446–9458 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tritsch、NX、Granger、AJ & Sabatini、BL GABA 同時放出のメカニズムと機能。 ナット。 神経科学牧師。 17、139–145 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

アルカモ、EA 他 Satb2 は、発達中の大脳皮質における脳梁投射ニューロンのアイデンティティを制御します。 ニューロン 57、364–377 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Molyneaux、BJ、Arlotta、P.、Menezes、JRL、Macklis、JD 大脳皮質におけるニューロンサブタイプの仕様。 ナット。 神経科学牧師。 8、427–437 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Huang、J.ら。 神経障害性疼痛の下行性調節を活性化する神経回路。 ナット。 神経科学。 22、1659–1668 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ロス・ブライアン、L. DREADDs は神経科学者向け。 ニューロン 89、683–694 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bennett, GJ & Xie, YK ラットの末梢単神経障害で、人間に見られるような痛覚障害を引き起こします。 ペイン 33、87–107 (1988)。

Bourgeais, L.、Gauriau, C. & Bernard, JF 扁桃体中心核の侵害受容領域から前脳への投影: ラットにおける PHA-L 研究。 ユーロ。 J. Neurosci. 14、229–255 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Detari, L.、Semba, K. & Rasmusson, DD ウレタン麻酔したラットにおける脳幹および感覚刺激に対する皮質 EEG 関連基底前脳ニューロンの反応。 ユーロ。 J. Neurosci. 9、1153–1161 (1997)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang、YQ、Mei、J.、Lu、SG、Zhao、ZQ 末梢侵害受容刺激に対する基底核大細胞ニューロンの応答における加齢に伴う変化。 脳解像度 948、47–55 (2002)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Gross, J.、Schnitzler, A.、Timmermann, L.、Ploner, M. 人間の一次体性感覚皮質におけるガンマ振動は、痛みの知覚を反映します。 PLoSバイオル。 5、e133 (2007)。

論文 PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

タン、LLら。 体性感覚皮質のガンマ振動は、嫌悪感と侵害受容において前頭前野および下行性セロトニン作動性経路を動員します。 ナット。 共通。 10、983–999 (2019)。

論文 ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

シュルツ、E. et al. 前頭前部ガンマ振動は、人間の強直性疼痛をコード化します。 セレブ。 Cortex 25、4407–4414 (2015)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Ploner, M. & Gross, J. ガンマ振動は動物と人間の痛みを形成します。 トレンド認知度科学。 23、1086 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

Paquette, T.、Tokunaga, R.、Touj, S.、Leblond, H. & Piche, M. 侵害受容処理中のメイナート基底核による皮質血流応答の調節。 神経科学。 解像度 149、22–28 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

Pafundo, DE、Miyamae, T.、Lewis, DA & Gonzalez-Burgos, G. 前頭前皮質回路におけるニューロン興奮性のコリン作動性調節と反復性興奮抑制: ガンマ振動への影響。 Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ． 591、4725–4748 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ハウ、WM et al. 前頭前皮質でのアセチルコリンの放出は、合図検出中のガンマ振動とシータ-ガンマ結合を促進します。 J. Neurosci. 37、3215–3230 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schweinhardt, P. & Bushnell, MC 健康と病気における痛みのイメージング – 私たちはどこまで進んでいるでしょうか? Ｊ．クリン． 調査します。 120、3788–3797 (2010)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tracey, I. 痛みを伴う神経画像メカニズム: 発見から翻訳まで。 痛み 158(補足 1)、S115–S122 (2017)。

記事 MathSciNet PubMed Google Scholar

Kim、JA & Davis、KD 神経振動: 痛みの神経コードの理解。 Neuroscientist 27、544–570 (2020)。

Vierck, CJ、Yezierski, RP & Wiley, RG ラットにおけるコリン作動性前脳基底核 (CBF) ニューロンの喪失後の疼痛感受性。 神経科学 319、23–34 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

江、YYら。 慢性疼痛の内側中隔コリン作動性調節における神経経路：前帯状皮質と腹側海馬の明確な寄与。 痛み 159、1550–1561 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

デール、J. et al. 皮質制御をスケールアップすると、痛みが抑制されます。 Cell Rep. 23、1301–1313 (2018)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

タレー、RS et al. 前頭前皮質の抗侵害受容機能を薬理学的に回復させると、慢性的な痛みが軽減されます。 プログレ。 ニューロビオール。 201、102001 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ガン、Z.ら。 反復的な非侵襲性前頭前野刺激は、マウスの神経リモデリングを介して神経因性疼痛を逆転させます。 プログレ。 ニューロビオール。 201、102009 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Radzicki, D.、Pollema-Mays, SL、Sanz-Clemente, A.、Martina, M. M1 受容体依存性コリン作動性興奮の喪失は、神経因性疼痛における mPFC 不活性化に寄与します。 J. Neurosci. 37、2292–2304 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

古賀和也ほか前帯状皮質のムスカリン性 M1 受容体を刺激すると、神経損傷ラットの GABA 作動性伝達を介して機械的過敏症が軽減されます。 脳解像度 1704、187–195 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ダンクレー、P. et al. 内臓痛と体性痛の注意力の調整。 神経胃腸ロール。 モチル。 19、569–577 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ploner, M.、Lee, MC、Wiech, K.、Bingel, U.、Tracey, I. 前刺激の機能的接続性が人間の痛みの知覚を決定します。 手順国立アカデミー。 科学。 USA 107、355–360 (2010)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

バリキ、ミネソタ州およびアプカリアン、AV 侵害受容、痛み、否定的な気分、および行動選択。 ニューロン 87、474–491 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eldufani, J. & Blaise, G. 加齢における慢性疼痛と認知機能に対するネオスチグミンやリバスチグミンなどのアセチルコリンエステラーゼ阻害剤の役割: 最近の臨床応用のレビュー。 アルツハイマー型認知症。 5、175–183 (2019)。

記事 Google Scholar

Laalou、FZ et al. 全身（プロポフォール）麻酔の媒介における基底コリン作動性前脳の関与。 麻酔学 108、888–896 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Mathias, JL, Cant, ML & Burke, ALJ 慢性疼痛を抱えて暮らす成人の睡眠障害と睡眠障害：メタ分析。 寝る。 医学。 52、198–210 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Choy, EH 痛みと線維筋痛症における睡眠の役割。 ナット。 リウマトール牧師。 11、513–520 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

Qi、J.ら。 メイネルト基底核と前帯状皮質の間の機能的接続の変化は、完全な睡眠不足後の注意力の低下と関連しています。 行動脳研究所 409、113321 (2021)。

記事 Google Scholar

Liu、AKL、Chang、RC-C.、Pearce、RKB & Gentleman、SM メイナート基底核を再考: アルツハイマー病とパーキンソン病における解剖学、歴史、および異なる関与。 Acta Neuropathologica 129、527–540 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lv、Qら。 脳深部刺激：アルツハイマー病（AD）およびパーキンソン病認知症（PDD）における認知症の治療法となる可能性があります。 フロント。 神経科学。 12、360 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Gratwicke、J. et al. レビー小体型認知症およびパーキンソン病認知症におけるメイネルト基底核と淡蒼球の安静時活動と接続性。 ニューロイメージ 221、117184 (2020)。

論文 PubMed Google Scholar

オズワル、A.ら。 パーキンソン病およびレビー小体型認知症におけるマイネルト基底核の皮質接続性。 脳: J. Neurol. 144、781–788 (2021)。

記事 Google Scholar

Lowell, BB、Olson, D. & Yu, J. ChAT-IRES-Cre マウスの発生と表現型。)。 MGI J:114556 (2006)。

Dixon、WJ 実験観察の効率的な分析。 アンヌ。 ファーマコル牧師。 有毒。 20、441–462 (1980)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Humby, T.、Laird, FM、Davies, W. & Wilkinson, LS マウスにおける視空間的注意機能: コリン作動性操作と遺伝子型の間の相互作用。 ユーロ。 J. Neurosci. 11、2813–2823 (1999)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Paxinos, G. & Franklin, KBJ 『定位座標におけるマウスの脳』第 2 版 （アカデミックプレス、2001）。

Oswald, MJ、Han, Y. & Kuner, R. 慢性疼痛における前脳前脳皮質の調節を介したコリン作動性マイネルト基底核の新たな役割 [電気生理学データセット]。 heiDATA https://doi.org/10.11588/data/ET9G9X (2022)。

Pachitariu, M.、Steinmetz, NA、Kadir, SN、Carandini, M. & Harris, KD KiloSort を使用した高チャネル数プローブの高速かつ正確なスパイク選別。 上級神経情報プロセス。 システム。 29、4448–4456 (2016)。

Google スカラー

Van der Maaten, L. & Hinton, G. t-SNE を使用したデータの視覚化。 J. 機械学習研究所 9、2579–2605 (2008)。

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著者らは、事務局の支援については C. Gartner 氏、優れた技術支援については N. Gehrig、V. Buchert、D. Baumgartl-Ahlert、および B. Zimmermann に感謝しています。 この研究は、CRC1158 慢性疼痛コンソーシアム (プロジェクト B01、B06) の助成金の形で、RK に対するドイツ政府機関によって支援されました。 MO は CRC1158 基金からシード助成金を受け取りました。 著者らは、ZG に対するユニオン病院、同済医科大学、華中科技大学からの奨学金支援、HL に対する中国奨学会からの奨学金支援、およびドイツ国民功労学院 (ドイツ国民功績プログラム) からの PVN および若い科学者のキャリアに感謝の意を表します。 CRC1158 ファンドからのフェローシップ。 著者らは、バーデン ヴュルテンベルク科学研究芸術省 (MWK) およびドイツ研究財団の支援による行動実験およびデータ ストレージ サービス (SDS@hd) の支援について、ハイデルベルク医学部の学際的神経行動中核施設に感謝の意を表します。 (DFG) INST 35/1314-1 FUGG および INST 35/1503-1 FUGG を許可します。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセスの資金調達。

ハイデルベルク大学医学部薬理学研究所、Im Neuenheimer Feld 366、69120、ハイデルベルク、ドイツ

マンフレッド・J・オズワルド、イェチャオ・ハン、ハン・リー、サミュエル・マラシュリ、デニズ・ヌーリ・オグロ、バヴィヤ・オジャ、ポール・V・ナセル、ジェン・ガン、ロヒニ・クナー

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MO、YH、ZG、HL、DU、BO、SM、および PVN は、電気生理学プロトコルの計画と実行を支援する RKMO の監督の下ですべての湿式実験を実行しました。 RK はプロジェクトの概念を作成し、すべての著者が定期的に概念的なインプットを提供しました。 MO、HL、ZG が図を作成しました。 RK が原稿を書き、すべての著者が原稿の執筆とデータの提示においてコメントと体系的な情報を提供しました。

ロヒニ・クナーへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Patrick Sheets と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

オズワルド、MJ、ハン、Y.、リー、H. 他コリン作動性のメイネルト前脳基底核は、前辺縁皮質の調節を介して慢性的な痛みのような行動を調節します。 Nat Commun 13、5014 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32558-9

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受信日: 2022 年 1 月 29 日

受理日: 2022 年 8 月 3 日

公開日: 2022 年 8 月 25 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32558-9

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