以上のエピジェネティックなメカニズム

May 20, 2023

Molecular Psychiatry volume 27、pages 4893–4904 (2022)この記事を引用

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過度の恐怖は不安障害の特徴であり、世界中で病気の負担の主な原因となっています。 恐怖と不安の調節における前頭前皮質-扁桃体回路の役割を裏付ける実質的な証拠があるが、その活動を調節する分子機構はまだ十分に理解されていない。 今回我々は、背内側前頭前野におけるヒストンメチルトランスフェラーゼPRDM2の下方制御が、恐怖記憶の固定化を調節することによって恐怖表現を増強することを示す。 さらに、背内側前頭前皮質から扁桃体基底外側に投射するニューロン（dmPFC-BLA）におけるPrdm2ノックダウン（KD）が恐怖発現の増加を促進することを示す。 また、dmPFC-BLA回路におけるPrdm2 KDは、シナプス形成に関与する遺伝子の発現増加をもたらし、これは、Prdm2 KDが、dmPFC-BLA投射標的におけるシナプス強度を修飾することによって、条件付けされた恐怖の強化を調節することを示唆している。 シナプス効果の増強と一致して、dmPFC Prdm2 KD が BLA におけるグルタミン酸作動性放出確率を増加させ、恐怖に関連した合図に応答して BLA ニューロンの活動を増加させることがわかりました。 まとめると、我々の発見は、PRDM2が特定のトランスクリプトーム変化を通じてdmPFC -BLA回路を調節するという、過剰な恐怖反応の新しい分子機構を提供する。

通常の恐怖は、生命を脅かす出来事から逃れることを目的とした適応反応を引き起こします[1、2]。 対照的に、過剰な恐怖反応は非適応的となり、心的外傷後ストレス障害やいくつかの不安障害などの恐怖関連障害の特徴です[3]。 学習された恐怖に関与する記憶プロセスの病理は、関連する脅威がないにもかかわらず消えない行動反応の増幅につながる可能性があります[4]。 過度の恐怖記憶の根底にある神経回路と分子機構を特定することで、機構的治療の標的となり得る分子経路を特定できる可能性があります。

恐怖条件付けを使用した研究により、恐怖の記憶処理に関与する脳構造が特定されました [5、6]。 これらの中で、扁桃体中心部 (CeA) と扁桃体側底部 (BLA) を含む扁桃体複合体は、パブロフの恐怖条件付けにとって重要です [7]。 CeA は条件付き恐怖反応の発現に関与しているのに対し、BLA は条件付き刺激と無条件刺激間の関連が形成され保存される一次部位として機能します [8]。 扁桃体は、感情調節に重要な脳領域である前頭前皮質 (PFC) と広範囲に相互接続されています [9]。 背内側前頭前野 (dmPFC; 前辺縁および帯状皮質) および腹内側前頭前野 (辺縁下) を含む PFC も、恐怖記憶処理に関与すると考えられています [10、11]。 特に、dmPFC から BLA への投影の活性化は、恐怖表現のトップダウン制御と関連しています [12、13、14、15]。 しかし、恐怖記憶処理の dmPFC -BLA 経路調節を調節する分子機構はまだ完全には理解されていません。

恐怖記憶プロセスの調節におけるエピジェネティックなメカニズムの役割を示す証拠が増えている[16、17]。 ストレスの多い出来事を含む過去の経験は、遺伝子発現の変化を通じて「再プログラミングプロセス」を引き起こす可能性があります。 エピジェネティックな制御は、経験に依存して転写と翻訳を変化させる重要なメカニズムであると考えられています [18] [19、20、21]。 したがって、エピジェネティックなプロセスによって媒介される遺伝子発現の広範な調節不全は、外傷性ストレスへの曝露とストレス関連障害の発症とを結びつける可能性がある。

我々は以前、アルコール依存症の病歴によるヒストンメチルトランスフェラーゼPR含有ドメイン2（PRDM2）の下方制御がストレス反応の増加と関連していることを発見した。 PRDM2 は、ヒストン H3 リジン 9 にメチル基を付加することにより遺伝子サイレンシングを促進します [22]。 PRDM2 は脳に非常に豊富に存在し、dmPFC のニューロンで選択的に発現されており、このことはニューロン機能におけるこのエピジェネティックな酵素の役割を示唆しています [23]。 したがって、本発明者らは、dmPFC における Prdm2 ノックダウン (KD) がストレス誘発性のアルコール探索の再発を促進することを発見した[23]。 行動レベルと神経レベルの両方で、過度のアルコール摂取と恐怖関連障害との関連性を示す文献が増えている[24、25、26、27、28]。 したがって、ここで我々は、dmPFCにおけるPrdm2欠損が、恐怖に関連する脳回路における遺伝子発現変化を促進することによって、病的恐怖の発症に寄与している可能性があると仮説を立てた。

この仮説を検証するために、ラット dmPFC の Prdm2 をノックダウンし、条件付き恐怖の獲得、発現、および消滅に対する効果を評価しました。 条件付き恐怖の手がかりにおける BLA への dmPFC 投射の重要な役割を考慮して [12、13、29、30]、我々は次に投射特異的戦略を使用して、Prdm2 KD がこの神経経路を介して恐怖を調節するかどうかを決定しました。 次に、ウイルス翻訳リボソームアフィニティー精製 (vTRAP) とハイスループット RNA シーケンス (RNAseq) を使用して、回路特異的な方法で Prdm2 KD の下流分子の影響を特定しました。 この分析により、シナプス活動の制御に関与するタンパク質をコードする転写産物の広範な上方制御が特定されたため、最終的に、扁桃体スライスのパッチクランプ記録を使用して、BLAへのグルタミン酸作動性入力に対するPrdm2 KDの影響を調査し、シナプス活性の調節中にdmPFC-BLAニューロンの活動を測定しました。生体内ファイバー測光による恐怖記憶検査。

成体雄の Wistar ラット (200 ～ 225 g、Charles River、ドイツ) を逆光サイクル下で無制限の餌と水で飼育しました。 手順はスウェーデンの全国動物研究委員会に従っており、リンシェーピング大学の動物管理および使用に関する地域倫理委員会によって承認されました。

この研究では 9 バッチのラットを使用しました (N = 268)。 動物のグループ分けはランダムに割り当てました。 実験 1 (n = 17 スクランブルおよび 20 Prdm2 KD) では、ラットの恐怖記憶の獲得、発現 (24 時間後)、および消滅についてテストされました。 実験 2 (スクランブル: n = 12 および Prdm2 KD n = 12) では、条件付けの 1 週間後のラットの恐怖記憶の発現と、状況の一般化および足の衝撃感受性をテストしました。 実験 3 (n = 17 スクランブルおよび 20 Prdm2 KD) では、手がかり恐怖条件付けの 24 時間後に Prdm2 KD が恐怖発現を増加させる効果を再現しました。 恐怖条件付けを受ける前に、ラットの EPM および運動活動における不安をテストしました。 血漿コルチコステロンレベルは、ベースライン時、条件付け後、および恐怖記憶の発現テスト後に測定されました。 恐怖発現試験の 1 週間後、ラットを安楽死させ、遺伝子発現解析のために dmPFC を収集しました。 実験 4 (スクランブル: n = 20 および Prdm2 KD n = 18) では、Prdm2 のウイルス媒介 KD の 1 週間前にラットを恐怖刺激に慣れさせ、手術の 1 か月後に恐怖の発現についてテストしました。 実験 5 (スクランブル: n = 12 および Prdm2 KD n = 12) では、ラットの新規物体認識がテストされました。 実験 6 (スクランブル: n = 20 および Prdm2 KD n = 19) では、条件付けの 24 時間後の恐怖記憶の発現に対する、BLA に特異的に投射するニューロンにおける Prdm2 KD の影響を調べました。 実験 7 (スクランブル: n = 18 ラット; 3 つの dmPFC および Prdm2 KD のプール n = 18 ラット; 3 つの dmPFC のプール) では、vTRAP を使用して、特に dmPFC から BLA に突き出ているニューロンにおける Prdm2 KD 後の遺伝子発現を分析しました。 。 実験 8 (スクランブル: 5 匹のラットからの n = 14 細胞および 6 匹のラットからの Prdm2 KD n = 15 細胞) では、ex vivo 電気生理学を使用して、Prdm2 KD 後の BLA ニューロンへのグルタミン酸放出の変化を調査しました。 最後に、実験 9 (スクランブル: n = 9 および Prdm2 KD n = 13) では、生体内ファイバー測光法を使用して、BLA における Prdm2 KD の影響をさらに調査しました。 この研究で行われた実験の概要を補足図S1に示します。

恐怖条件付け中、ラットは特定の視覚および匂いの手がかりを備えた部屋で条件付けされ、30 秒の中性キュートーン (2.9 kHz、80 dB、試行間隔: 3分; Med Associates Inc.、セントオールバンズ、バーモント州、米国）。 ラットは、さまざまな視覚的および臭気的手がかりを備えた部屋で、6×30秒のキュートーンに曝露され、恐怖記憶の発現についてテストされました（詳細については補足方法を参照）。 さらに 2 日間にわたって恐怖表現テストを繰り返すことにより、絶滅を調査しました。 恐怖発現は、採点時にラットのグループの同一性を知らなかった訓練を受けた２人の実験者によって、３０秒間の緊張中にすくむのに費やした時間の％として測定された。 恐怖記憶の発現と消滅は、セッション内で消滅が観察される可能性があるため、毎日のテストセッション中のブロック 1 (トーン 1 および 2) の平均として表示されます。

通常、短期記憶の研究には新しい物体認識が使用されるため、オブジェクトはカスタムビルドされ、インタラクティブ（登れる）になっており、探索時間と記憶獲得を向上させました[31]（補足図S3）。 ラットは、物体 A または物体 B のコピー 2 つに慣れるまで 10 分間与えられました。翌日、見慣れた物体の 1 つを新しい物体と置き換えることにより、新しい物体認識について 5 分間テストされました。 データは、新規オブジェクトの探索に費やした時間/(新規 + 馴染みのあるオブジェクトの探索に費やした時間) として定義される認識インデックスとして表示されます。

基礎不安様行動は、以前に記載されているように高架十字迷路パラダイム (EPM) を使用して測定されました [32、33]。 データは、開アームでの時間%、すなわち開アームでの時間/(開アームでの時間 + 閉アームで費やした時間) *100として表されます。

運動活動は、赤外線ビーム検出システム (Med Associates Inc.) を備えた防音室 (43 × 43 cm) 内で周囲光レベル (190 ～ 210 ルクス) の下で 30 分間テストされました。 データは、5 分間隔の累積移動距離として表示されます。

足の衝撃感度の閾値は、Med Associates のボックスでテストされました。 ラットに、0.1 mA から開始して 0.1 mA ずつ増加する 0.5 秒間の足へのショックを与え、1、2、および 4 足の収縮を盲検観察者が記録しました。

ラットに、dmPFC への両側注入 (0.25 μl/注入; 速度: 0.1 μl/分; 前後: +3 mm、内側外側: ±0.6 mm、背腹: -3.5 mm [34]) を含むアデノ随伴ウイルス (AAV) を投与した。 Prdm2 を標的とする短いヘアピン RNA (AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40; GGAGCCCAAGTCCTTGTAAAT; 力価: 5.6E13 GC/mL; UPenn Core Facility, Philadelphia, PA) またはスクランブル コントロール (AAV9.HI.shR. luc.CMV.ZsGreen.SV40;力価:9.2E13 GC/mL;UPenn Core Facility、PA)。

ラットは、Cre依存性のAAVをdmPFCに両側から注入した（0.25μl/注射、速度：0.1μl/分、座標：前後方向：+3 mm、内側外側：±0.6 mm、背腹方向：-3.5 mm [34]）。 Prdm2 をターゲットとするマイクロ RNA (AAV9.hSyn.DIO.-mcherry.miR.Prdm2.WPRE; GGAGCCCAAGTCCTTGTAAAT; 力価: 3.24E13 GC/ml; UPenn Core Facility, PA) またはスクランブル コントロール (AAV9.HI.shR.luc.CMV.また、ラットには、Cre をコードする逆行性輸送 AAV の両側注入も行われました (0.5 μl/注入; 速度: 0.1 μl/分; AAV-retro2-hSyn1-EGFP_iCre-WPRE-hGHp(A); 力価: 7.8 × 10E12 GC/mL;Addgene、マサチューセッツ州ウォータータウン）を BLA（前後方向：-2.4 mm、内側外側：±5 mm、背腹方向：-8.4 mm [34]）に注入しました。

ラットは、上記のように、Prdm2を標的とするshRNAまたはスクランブル対照を含むAAVベクターのdmPFCへの両側注入を受けた。 ラットには、GcaMP6s をコードする AAV (0.5 μl/注入、速度: 0.1 μl/分、AAV9.CaMKII.GcaMP6s.WPRE.SV40、力価: 2.1E13 GC/mL、Addgene、ウォータータウン、マサチューセッツ州) の BLA への片側注入も受けました。 (前後: -2.4 mm、内側外側: ±5 mm、背腹: -8.4 mm)。 ベクター注入後、チタン M3 レセプタクル (Doric Lenses、カナダ、ケベックシティ) に取り付けられた 400 µm コア、0.66NA ホウケイ酸光ファイバーを BLA の背側に移植しました (前後: -2.4 mm、内側外側: ±5 mm、背腹: −8.5mm）。 レセプタクルは、頭蓋骨ネジ、瞬間接着剤、および黒色の Ortho-Jet 歯科用アクリル (Riss-Dental、ハーナウ、ドイツ) の組み合わせを使用して頭蓋骨に固定されました。

恐怖条件付けセッションの前の数日間、ラットをファイバーパッチコードに接続することに慣れさせた。 恐怖記憶の手がかり発現は、条件付けの24時間後に再び評価され、カルシウム活性の代用としてGCaMP6sが発する蛍光が、軽微な修正を加えた以前に記載された方法[35、36、37]を使用してセッション全体にわたって測定された。 簡単に説明すると、GCaMP6 は、二色性光で反射された 2 つの正弦波変調 LED (465 と 405 nm でそれぞれ 330 Hz と 210 Hz) から発生する光によって 2 つの波長 (465 nm、カルシウム依存信号、および 405 nm 等浸透圧制御) で励起されました。ミラー（4 ポート蛍光ミニキューブ、ドーリック レンズ）を使用し、400 μm 0.57NA 光ファイバー パッチ コードに結合し、ファイバー インプラントに接続しました。 両方の波長の光強度は、パッチ コードの先端で 10 ～ 15 µW に調整されました。 両方のチャネルから放射された信号は、同じ光ファイバーを通って戻り、蛍光ミニキューブに組み込まれた光センサーを使用して 6.1 kHz で取得され、復調 (ロックイン増幅) され​​、1017.3 kHz でデジタル化され、リアルタイム信号プロセッサー ( RZ5D; Tucker Davis Technologies、米国フロリダ州アラチュア）。 トーン (CS+) のオンセットとオフセットの行動タイムスタンプは、Med-Associates の行動チャンバーからリアルタイム シグナル プロセッサへの TTL 入力によってデジタル化されました。

さらなるオフライン分析のために、ファイバーの正しい配置とファイバー先端直下の GcaMP 発現 (死後検査)、および観察可能なカルシウム活性 (セッション全体の痕跡の視覚的検査) を持つラットのみが含まれました。 この分析は、Python スクリプトに基づいてカスタム作成されたグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) を使用して実行されました。 生の 465 nm および 405 nm 信号は、最初にダウンサンプリング (50 倍) され、平滑化されました (ウィンドウ サイズ 10 サンプルのゼロ位相移動平均フィルター)。 次に、トーン開始の周囲の -30 秒と 40 秒を含む時間枠で、イベントごとのヒストグラムを試行ごとに作成しました。 最後に、データのトレンドを除去して、動き、光退色、およびファイバー曲げアーティファクトを除去しました。 試行ごとに、線形多項式回帰を使用して両方のチャネルからの信号を時間曲線に独立して当てはめ、両方のチャネルの予測信号を生成しました。 測定された生の信号から予測信号を減算すると、各チャネルの ΔF が得られ、その後、チャネルの予測信号で除算することで正規化され、ΔF/F が得られます。 次に、465 nm および 405 nm チャネルからのトレンド除去されたシグナルを相互に差し引いて、正規化されたカルシウム依存性 GCaMP 蛍光シグナル (% ΔF/F) を計算しました。

Prdm2 KD の下流、特に dmPFC から BLA に突き出ているニューロンにおける分子機構を同定するために、ウイルス翻訳リボソーム精製 vTRAP 法を使用しました。 この方法では、増強型緑色蛍光タンパク質（EGFP）タグ付きリボソームサブユニット（L10a）をコードする構築物が、例えばCre/loxシステムを使用して、対象のニューロン集団において選択的に発現される。 EGFP タグ付きサブユニットは、トランスフェクトされた細胞のリボソームに組み込まれます。 これらのタグ付きリボソームは、それに結合した翻訳 RNA とともに免疫沈降によって単離され、RNAseq を使用した遺伝子発現解析に供されます。 TRAP を使用する主な利点は、リボソームに関連付けられた mRNA が翻訳の過程にあることです。 翻訳は、遺伝子発現制御イベントの多くがすでに起こった後に発生するため、mRNA の翻訳はタンパク質レベルとより密接に相関します [38]。

ラットは、Prdm2 を標的とする shRNA を含む AAV9 の 1:4 部分、またはスクランブル対照と、Cre 依存性の EGFP タグ付きリボソーム サブユニットをコードする AAV5 の 3:4 部分を含むウイルス カクテルを dmPFC 内で両側注入されました ( EGFP-L10a; AAV5-FLEX-EGFPL10a; 力価: 7 × 10¹² vg/mL)。 ラットには、AAV2-retro エンコード Cre の BLA への両側注入（0.5 μl/注入、AAV-retro/2-hSyn1-mCherry_iCre-WPRE-hGHp(A)、力価：5.0 × 10E12 vg/mL）も投与されました（前後： −2.4 mm、内外側：±5 mm、背腹：−8.4 mm）[34]。 dmPFC-BLA 投影ニューロンの単離は、以前に記載されているように実行されました [39]。 簡単に説明すると、dmPFC を解剖し、サンプルを溶解バッファー (10 mM HEPES-KOH、pH 7.4、150 mM KCl、5 mM MgCl2、0.5 mM DTT、100 mg/mL シクロヘキシミド、RNasin、Promega および SUPERase-In™) 中でホモジナイズしました。 、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム；ＲＮａｓｅ阻害剤、および完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤、Ｒｏｃｈｅ、バーゼル、スイス）。 サンプルは 3 回の遠心分離ステップを受け、それぞれ 1 回目と 2 回目の遠心分離後の上清に 10% NP-40 と 300 mM DHPC が添加されました。 ポリソーム免疫沈降は、ビオチン化プロテイン L (Pierce; Thermo Fisher Scientific) でコーティングされたストレプトアビジンに結合したモノクローナル抗 EGFP 抗体 (Memorial Sloan-Kettering Monoclonal Antibody Facility、クローン名: Htz-GFP-19F7 および Htz-GFP-19C8) を使用して実行されました。・共役磁気ビーズ（Life Technologies）。 次に、Absolutely RNA Nanoprep キット (Agilent Technologies、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を使用して RNA を精製しました。 RNA 濃度と完全性は、バイオアナライザー RNA 6000 Pico アッセイを使用して測定され (RNA 濃度: ～990 pg/μl、RIN 9.5 ～ 10)、RNAseq のために National Genomics Infrastructure (NGI、スウェーデン) に送信されました。

サンプルは、NovaSeq6000 (NovaSeq Control Software 1.7.0/RTA v3.4.4; Illumina, Inc.、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) で 151nt(Read1)-10nt(Index1)-10nt(Index2)-151nt(Read2) でシーケンスされました。 ) 「S4」モードのフローセルで「NovaSeqXp」ワークフローを使用したセットアップ。 Bcl から FastQ への変換は、CASAVA ソフトウェア スイートの bcl2fastq_v2.20.0.422 を使用して実行されました。 使用される品質スケールは Illumina 1.8 です。

シーケンスデータの品質は、FastQC と Preseq を使用して評価されました。 高品質のトリミングとアダプター配列を削除するトリミングは TrimGalore を使用して行われました。 STAR アライナー ソフトウェアを使用して、トリミングされたシーケンシング リードを、関連するアノテーション データを含む Ensembl 参照ラット ゲノム Rnor_6.0 に位置合わせしました。 アライメントの品質はQualimapを使用して評価され、アライメントされたリードのゲノム特徴へのマッピングはfeatureCountsを使用して実行されました。 結果は MultiQC を使用して要約されました。

ダウンストリーム分析は、R プログラミング言語と Rstudio を使用して行われました。 カウントデータの分散およびライブラリサイズの正規化は、主成分分析の前に分散安定化変換 (VST) を適用することによって行われました。 差次的遺伝子発現解析は、R パッケージ DESeq2 を使用して実行されました。 0.05未満にp値を調整した誤検出率を、統計的有意性のカットオフとして使用しました。

Ingenuity Pathway Analysis (IPA; Agilent Technologies) ソフトウェアを使用して、経路内で相互に接続されている遺伝子を特定しました。 IPA をサポートするデータベースには 700 万件を超える調査結果が含まれており、継続的に更新されます。 IPA が使用するアルゴリズムを使用すると、特定の経路に豊富に含まれる遺伝子を特定できます。 また、経路の活性化/阻害の予測も提供するため、特定された遺伝子発現の変化が特定の経路の活性化または阻害を引き起こす可能性があるかどうかが示されます。 RNA-seq データの基礎となるパターンをさらに調査するために、デフォルトのパラメーターを備えた WGCNA R パッケージを使用して、加重遺伝子共発現ネットワーク解析 (WGCNA) を実行しました。 このアプローチを通じて、VST で正規化された読み取りカウント データに基づいて、重み付けされた遺伝子共発現ネットワークが構築されました。 相互に接続され、高度に共発現される遺伝子のモジュールは、最小モジュール サイズ 30 遺伝子を使用して同定され、同様の発現プロファイル (相関 > 0.75) を持つモジュールがマージされました。 R の limma パッケージを使用してデータに線形モデルを当てはめることにより、差次的発現解析を実行し、Prdm2 KD とスクランブル対照サンプル間の各モジュールの発現プロファイルを比較しました。 モジュール遺伝子は、R パッケージのclusterProfiler を使用して、Gene Ontology ナレッジベースのデータに基づいて機能強化のために分析されました。

実験 3 および 6 の完了後、脳を取り出して急速冷凍しました。 12 μm の脳切片を dmPFC レベルで収集し、使用するまで -80 °C で保管しました。 in situ ハイブリダイゼーションは、RNAscope Fluorescent Multiplex Kit User Manual (Advanced Cell Diagnostics、Newark、CA) に従い、以前に記載されているように実施しました [23]。 Prdm2 プローブ (アクセッション番号 NM_001077648.1) は、Advanced Cell Diagnostics (米国カリフォルニア州ニューアーク) から購入しました。 簡単に説明すると、転写物を個別に定量できるレベルまで増幅するように設計された一連の 4 つのプローブとともに切片を 40 °C でインキュベートしました。 これには、Prdm2 ターゲット プローブ、プリアンプ プローブ、アンプ プローブ、および Prdm2 転写物を視覚化するための C1 チャネルの蛍光標識プローブ Atto 550 (赤) が含まれます。 定量化のための顕微鏡写真は、倍率 20 倍の共焦点顕微鏡 (Zeiss LSM 700; Carl Zeiss AG、イエナ、ドイツ) を使用して取得しました。 Prdm2 mRNA レベルは、蛍光シグナルの総ピクセルとして評価されました。 各ピクセルが単一の mRNA 分子を表すと仮定しました。 総 Prdm2 陽性ピクセルは、ImageJ ソフトウェア (米国メリーランド州ベセスダの国立衛生研究所) を使用して閾値を自動的に調整した後に測定されました [40]。

脳をすぐに取り出し、92 NMDG、20 HEPES、25 グルコース、30 NaHCO3、1.2 NaH2PO4、2.5 KCl、5 mM を含む氷冷 N-メチル-D-グルカミン (NMDG) ベースの切断溶液に入れました。アスコルビン酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム 3、チオ尿素 2、MgSO4 10、および CaCl2 0.5 (310 mOsm、pH 7.4)。 PFC または BLA のいずれかを含む急性冠状脳スライス (厚さ 250 μm) を、ビブラトーム (Leica VT1200 S、Leica Biosystems Inc.、イリノイ州、米国) を使用して取得しました。 切断後、スライスを、(mM) 92 NaCl、20 HEPES、25 グルコース、30 NaHCO3、1.2 NaH2PO4、2.5 KCl、5 ナトリウムを含むあらかじめ温めた (約 34 °C) 保持溶液で満たされた保持チャンバーに移しました。アスコルビン酸塩、3 ピルビン酸ナトリウム、2 チオ尿素、1 MgSO4、および 2 CaCl2 (310 mOsm、pH 7.4)。 その後、保持溶液を室温に維持し、1 時間以上回復した後、単一のスライスを記録チャンバーに移し、温めた (約 30 ～ 32 °C) 流速で約 2.0 ml/min で連続的に灌流しました。人工脳脊髄液 (aCSF、mM): 125 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、1 MgCl2、11 グルコース、26 NaHCO3、2.4 CaCl2 (310 mOsm、pH 7.4)。 すべての溶液は 95% の O2 と 5% の CO2 で飽和しました。 自発性 EPSC (sEPSC) は、(mM 単位で) 135 K-グルコン酸塩、20 KCl、10 HEPES、0.1 EGTA、2 MgCl2、2 Mg を含むホウケイ酸ガラス パッチ ピペット (2.5 ～ 3.0 MΩ; Harvard Apparatus、MA、USA) を使用して記録されました。 -ATP、0.3 Na-GTP (290 mOsm、KOHを使用してpHを7.3に調整)。 誘発された EPSC (eEPSC) は、(mM) 140 Cs-メタンスルホン酸、5 NaCl、1 MgCl、10 HEPES、0.2 EGTA、2 Mg-ATP、0.5 Na-GTP、5 QX-を含む Cs ベースの細胞内溶液を使用して記録されました。 ３１４塩化物（２９０ｍＯｓｍ、ＣｓＯＨを使用してｐＨを７．３に調整）。 ペアパルス比は、eEPSC2とeEPSC1の間の比として分析されました(0.05Hz、50msのパルス間間隔、50μsの刺激持続時間)。 変動係数の逆二乗 (1/CV2) は、20 個の連続する eEPSC (0.05 Hz) の平均振幅の二乗と分散 (μ2/σ2) の比として測定されました。 分散対平均比 (VMR) は、分散を 20 個の連続する eEPSC (0.05 Hz) の平均振幅 (σ2/μ) で割ったものとして測定されました。 AMPA/NMDA 比は、AMPAR 媒介電流のピーク振幅 (-70 mV で測定) を NMDAR 依存成分 (eEPSC の開始後 50 ms で +40 mV で測定) で割ることによって測定されました。グルタミン酸作動性受容体遮断薬。 すべての記録は、GABAR ブロッカーであるピクロトキシン (100 μM) および CGP55845 (2 μM) の存在下、保持電位を -70 mV とした電圧固定モードで実行されました。 推定接合電位は、K-Gluc では 11 mV、Cs ベースの細胞内溶液では 8.5 mV であり、電気生理学的記録中に補正されませんでした。 結果はマンホイットニーテストを使用して分析され、すべての試薬と薬剤は Thermo Fisher Scientific から入手しました。

行動およびファイバー測光データは、Statistica 13.0 (TIBCO Software、米国カリフォルニア州パロアルト) を使用して分析し、グラフは Prism 9.1.2 (Graphpad Software LLC.、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して作成しました。 正規性は、Shapiro-Wilk テストを使用してチェックされました。 ピーク カルシウム応答データは、分析前に正規分布に一致するように対数変換する必要がありました。 分散の均一性は、Levene 検定を使用して評価されました。 データは均一性の仮定に違反しなかったため、対応のないスチューデント t 検定、一元配置分散分析、または二元配置反復測定分散分析を必要に応じて使用して分析しました。 すべての検定で許容された有意水準は p < 0.05 でした。 特に明記しない限り、データは平均値 ± SEM として表示されます。 RNA 配列データの分析と電気生理学的記録は上で説明されています。 各実験のサンプルサイズは、以前の同様の実験やパイロット研究で観察された変動に基づいています。 標的領域の外側にウイルス注射/光ファイバーが設置されたラットは研究から除外された。

Prdm2 KDが恐怖記憶プロセスに影響を与えるかどうかを評価するために、Prdm2を標的とするshRNAまたはdmPFC内のスクランブルshRNAを発現するAAVの両側微量注入をラットに受けました（図1A）。 Prdm2 KD により、dmPFC における Prdm2 の発現が約 50% 減少しました (図 1C、D; 一元配置分散分析: F(1,17) < 0.001、スクランブル: n = 9 および Prdm2 KD n = 10)。 ウイルス注入の 1 か月後に、ラットの恐怖記憶の獲得、発現、および消滅についてテストしました (図 1E)。 dmPFCのPrdm2 KDは恐怖記憶の獲得に影響を及ぼさなかったが（図1F）、緊張によって引き起こされたすくみ反応の強化によって測定されるように、条件付けセッションの24時間後に恐怖記憶の発現を有意に増加させたことがわかりました（図2G、図2G、 H; 一元配置分散分析: F(1,35) = 11.55; p = 0.002; スクランブル: n = 17 および Prdm2 KD n = 20)。

ウイルス注入部位と拡散の代表的なタイル スキャン。 B、C RNAscope 定量化に使用される代表的な画像。 Prdm2 の D KD は、dmPFC における Prdm2 の有意なダウンレギュレーションを誘導します。 E 実験スケジュール: 1 日目に、ラットに shRNA-Prdm2 またはスクランブル対照のいずれかを含む AAV9 を両側から注入しました。 次に、ラットの恐怖の獲得（31日目）、恐怖の発現（32日目）、および恐怖の消去（33〜34日目）についてテストしました。 Prdm2 の F KD は恐怖記憶の獲得に影響を与えませんでした (恐怖記憶の獲得は、条件付けセッション中のトーン 2 ～ 6 の平均として示されます) が、G は条件付けの 24 時間後に恐怖表現を有意に増加させました (フリージング % ±で示されます)。 SEM; N = 17–20/グループ)。 H 恐怖表現テストの最初の 2 つのトーンの平均。 I Prdm2 KD は消滅速度に影響を与えず、これは時間 x グループの相互作用が有意ではない (つまり、同様の傾き) ことによって示されます。 J 別のバッチ (N = 12/グループ) では、Prdm2 KD は条件付け後 1 週間でも恐怖表現を増加させることが判明しました。 K 恐怖記憶の獲得から1週間後にPrdm2をノックダウンした場合（N = 18〜20/グループ）、1か月後に測定された恐怖表現には影響は観察されませんでした。 *p < 0.05; **p < 0.01; p<0.001。

Prdm2 KD は、ショック感受性 (A)、運動活動 (B)、新規物体認識 (C)、および基礎的不安 (D) には影響しません。

次に、条件付けセッションの 48 時間後および 72 時間後に動物を発現テストに再曝露することにより、記憶の消失を評価しました。 二元配置反復測定 ANOVA は、時間の有意な効果 (F(2,70) = 64.2; P < 0.001) を示し、強力な消滅と、合図誘発すくみ反応に対するグループの有意な効果を示しました (図 1I; F (1,70) = 9.64; p = 0.003)。 ただし、減衰関数の傾きは平行であり、有意でない時間 × グループの交互作用を反映していました (F(2,70) = 1.58; p = 0.21)。 したがって、消滅速度は Prdm2 KD によって変化しませんでした。 消去速度は影響を受けなかったが、スクランブル対照と比較して、dmPFC Prdm2 KD を有するラットでは 3 日間の恐怖消去セッション後に恐怖発現の増加も観察された (F(1,35) = 4.10; P = 0.05)。 これは、恐怖記憶発現に対する Prdm2 KD の持続的な効果を示唆しています。 次に、Prdm2 KD の長期効果を評価するために、取得後 1 週間後の時点で恐怖記憶の発現をテストしました。 Prdm2 KD は、この時点でもフリーズに費やされる時間の割合を大幅に増加させたことがわかりました (図 1J; 一元配置分散分析: F(1,22) = 5.11; p < 0.05; スクランブル: n = 12 および Prdm2 KD n = 12)、Prdm2 KD の永続的な効果を示しています。 まとめると、これらのデータは、トランスクリプトームのエピジェネティックな再プログラミングと一致する時間経過で、Prdm2 KD 後の条件付き恐怖反応の上方制御を確立します。

Prdm2 KDは、恐怖の獲得に影響を与えることなく恐怖表現を特異的に増加させました（図1）。これは、PRDM2が無条件刺激（つまり、フットショック）と条件付き刺激（つまり、緊張）を結び付ける連合学習プロセスに影響を及ぼさないことを示しています。 Prdm2 KD は、記憶の固定化または記憶の想起に関与するプロセスを調節することにより、恐怖の発現を強化する可能性があります。 この疑問に対処するために、恐怖条件付けの 1 週間後に、Prdm2 に対する shRNA を含む AAV を dmPFC に注入しました。 shRNA が Prdm2 発現を安定して低下させるのに必要な時間を考慮すると、この時点までにほとんどの統合プロセスが dmPFC 内で形成されていました [13、41]。 これらの条件下では、Prdm2 KD ラットとスクランブル対照との間に差異は観察されなかった（図 1K; スクランブル: n = 20 および Prdm2 KD n = 18)。これは、dmPFC における Prdm2 KD が効果を介して恐怖表現の持続的な増加をもたらすことを示唆しています。記憶を呼び起こすのではなく、記憶の定着に重点を置いています。

足の衝撃感受性および運動活動に対するPrdm2 KDの効果は観察されず、恐怖表現に対するPrdm2 KDの特異的な効果を示唆しています（図2A、B;スクランブル：n = 20およびPrdm2 KD n = 20）。 また、新しい物体認識タスクを実行することによって、Prdm2 KD が他のタイプの記憶に影響を与えるかどうかをテストしたところ、認識インデックスにおける Prdm2 KD の影響は見つかりませんでした（図 2C; スクランブル: n = 12 および Prdm2 KD n = 12）。 不安様行動に対する Prdm2 KD の効果もテストされました。 我々は、Prdm2 KD ラットにおいて開腕時間のパーセンテージが減少する傾向を観察しました。 しかし、これは有意ではなく、Prdm2 が生得的な不安様行動に強い影響を与えないことを示唆しています (図 2D; スクランブル: n = 20 および Prdm2 KD n = 20)。

dmPFC -BLA 投影は恐怖表現の媒介に関与しています [12、13]。 したがって、我々は、Prdm2 KD が dmPFC-BLA 投影ニューロンの活動を調節することによって恐怖の発現を増加させる可能性があると仮説を立てました。 この仮説に対処するために、我々はまず、dmPFC-BLA投影ニューロンにおけるPrdm2の選択的KDが恐怖発現を増加させるのに十分であるかどうかを調査した。 我々はデュアルベクターアプローチを使用し、Creをコードする逆行性輸送AAVをBLAに注入し、Cre依存性Prdm2マイクロRNAをコードするAAVをdmPFCに注入しました（図3A、B）[42]。 投影特異的ではないdmPFCのPrdm2 KDで観察されたものと同様に、dmPFC-BLA投影ニューロンのPrdm2 KDは、条件付けされた恐怖の獲得には影響を与えませんでしたが（図3C）、24時間後の恐怖記憶の発現を有意に増加させました。取得 (図 3D; 一元配置分散分析: F(1,37) = 4.56; p < 0.05; スクランブル: n = 20 および Prdm2 KD n = 19)。 スクランブル対照と比較して、Prdm2 KD dmPFC-BLA グループの運動活動や不安様行動に違いは見られませんでした（それぞれ補足図4A、B）。 dmPFC Prdm2 KD グループで観察された傾向と同様に、オープンアームで費やされる時間の割合が減少する傾向が dmPFC-BLA Prdm2 KD グループで観察されました。

デュアル ウイルス アプローチを表す概略図。 B dmPFC および BLA でのウイルスの広がりを示すタイル スキャン、および AAV9-DIO-shRNA-PRDM2-ZS に感染した dmPFC ニューロンを示す代表的な画像 (緑色)、rAAV2 レトロ Cre-mCherry に感染した dmPFC ニューロン (赤色)、および dmPFC ニューロンを示す代表的な画像AAV9-DIO-shRNA-PRDM2-ZS 緑色と rAAV2 レトロ Cre-mCherry の同時感染 (黄色、スケール バー、50 μm)。 ｄｍＰＦＣからＢＬＡに投射するニューロンにおけるＰｒｄｍ２のＣ ＫＤ は、％すくみ±ＳＥＭとして測定される恐怖獲得に影響を与えなかった。 D dmPFC-BLA の Prdm2 KD は、条件付けの 24 時間後に恐怖表現を増加させるのに十分でした (N = 19-20)。 *p < 0.05。 BLA扁桃体基底外側、dmPFC背内側前頭前野。

Prdm2 KDがdmPFC-BLAによる恐怖記憶の強化を制御する下流の分子標的を同定するために、vTRAP戦略を使用してdmPFC-BLAニューロンのトランスラトームを配列決定した（図4A、B;スクランブル：n = 18ラット; 3つのプール） dmPFC および Prdm2 KD n = 18 ラット; 3 つの dmPFC のプール) [39]。

dmPFC-BLA ニューロンの Prdm2 KD は、シナプス形成に関与する遺伝子を制御します。 vTRAP 実験に使用されるトリプル ウイルス アプローチを表す概略図。 B dmPFC および BLA、および AAV5-FLEX-EGFPL10a に感染した細胞 (緑色)、rAAV2 レトロ Cre-mCherry に感染した細胞 (赤色)、および AAV5 の同時感染を示す細胞を提示する dmPFC ニューロンにおけるウイルスの拡散を示すタイル スキャン-FLEX-EGFPL10a および rAAV2 レトロ Cre-mCherry (黄色)。 C Prdm2 KD サンプルとスクランブル コントロールの別個のクラスターへの分離を示す主成分分析。 D Prdm2 KD 後に最も大きく変化した遺伝子を示すボルケーノ プロット。 E 相互接続され、高度に共発現される遺伝子をグループ化する階層的クラスタリング樹状図。 樹状図の下のカラーマップは、共発現された遺伝子のモジュールに対応します。 上部のカラーマップ: 初期に識別されたモジュール。 下部のカラーマップ: 類似した発現プロファイルを持つモジュールをマージした後のモジュール。 F Prdm2 KD とスクランブルコントロールを比較した、各共発現モジュールの差次的発現解析。 赤い水平破線は、FDR 補正された p 値の有意水準 0.05 を示します。 G モジュール「MEblue」の遺伝子発現プロファイルを条件間で比較する箱ひげ図。 KD: Prdm2 KD、SCR: スクランブル制御。 統計検定: 両側対応のない t 検定。 H モジュール「MEblue」内の遺伝子の遺伝子オントロジー強化。 IIPAを使用して実行される遺伝子ネットワーク解析。 Prdm2 KD は、カドヘリン、ニューレキシン/ニューロリギン、エフリン/エフリン受容体ファミリー、および SNARE 複合体に属するタンパク質をコードする遺伝子の発現を増加させます。 J 選択されたシナプス形成関連遺伝子の差次的発現および有意水準。 棒プロットの垂直破線は、FDR 補正された p 値の有意水準 0.05 を示します。 BLA扁桃体基底外側、dmPFC背内側前頭前野。

我々は、Prdm2 KDがdmPFC-BLAニューロンの翻訳プロファイルを変化させるのに十分であることを発見した(図4C、D)。 vTRAP-RNAseqを使用して、22,091個の遺伝子を配列決定し、Prdm2 KDがこれらのうち3603個の発現を調節することを発見しました（補足表1：1877個が上方制御され、1726個が下方制御されました）。 予想どおり、Prdm2 KD は、dmPFC-BLA ニューロンにおける Prdm2 の発現を減少させました (補足表 1: adj p = 3.33E-23)。 WCNA分析により、相関性の高い遺伝子の合計32個の共発現モジュールが同定され、それらはさらに28個の異なるモジュールに統合されました（図4E）。 これらの２８個のモジュールのうち、「ＭＥｂｌｕｅ」と名付けられた最大のものは、Ｐｒｄｍ２ ＫＤとスクランブル対照との間で有意な差次的発現を示した（図４Ｆ、Ｇ）。 このモジュールは、シナプスの組織化や膜電位の調節などの生物学的プロセスの強化を示しました（図4H）。 また、IPA を使用して、機能に基づいて遺伝子をクラスター化しました。 私たちは、dmPFC-BLAニューロンのPrdm2 KDが、恐怖条件付け、不安、感情的行動、および記憶に関連する遺伝子の発現を調節することを発見しました（補足表2）。 WCNA分析と一致して、IPAによって同定された上位の重要な遺伝子ネットワークには、シナプス形成活性化に関連する遺伝子発現変化が含まれていました（図4I）。 このネットワークは、エフリン、ニューロリギン、およびニューレキシンファミリーに属する遺伝子、ならびにSNARE関連遺伝子（例えば、シナプトタグミン、図4I、J）から構成されていた。 これらの遺伝子ファミリーは、神経伝達と記憶形成に寄与することが知られている[43、44、45]。

我々のRNAseq分析によって同定された翻訳再プログラミングは、Prdm2 KDがdmPFC -BLA投影標的におけるシナプスのグルタミン酸放出を修飾することによって条件付けされた恐怖の強化を調節する可能性を指摘した。 この可能性を調べるために、スライス電気生理学実験を実施しました。 まず、スクランブル対照およびPrdm2 KDラットの推定BLA主ニューロンから記録されたsEPSCを測定することにより、BLA基底シナプス特性に対するdmPFC Prdm2 KDの影響を評価しました（図5A）。 Prdm2 KD ラットは、スクランブル対照と比較して sEPSC 頻度の増加を示しました (図 5B、C; スクランブル: 3.74 ± 0.45 Hz、n = 14; Prmd2 KD: 5.63 ± 0.70 Hz、n = 15; t(27) = 2.24、p < 0.05、対応のない t 検定)。 対照的に、Prdm2 KD ラットは振幅に有意な差を示さなかった（図 5D; スクランブル: 10.45 ± 0.41 pA、n = 14; Prmd2 KD: 10.71 ± 0.61 pA、n = 15; t(27) = 0.35、p = 0.73; 対応のない t 検定）および反応速度（立ち上がり時間: スクランブル: 2.16 ± 0.07 ms、n = 14; Prmd2 KD: 2.15 ± 0.06 ms、n = 15; t(27) = 0.08 p = 0.94、対応のない t 検定。減衰時間: sEPSC のスクランブル: 10.93 ± 0.51 ms、n = 14; Prmd2 KD: 10.43 ± 0.31 ms、n = 15; t(27)=0.85 p = 0.40、対応のない t 検定、データは示されていません)。 これらのデータは、dmPFC の Prdm2 KD が BLA 主要ニューロンへのグルタミン酸放出を増加させたことを示唆しています。

BLAを標的としたdmPFC末端におけるウイルス発現(AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40)を示す代表的な画像。 B スクランブルまたは Prdm2 KD ラットの BLA 推定主ニューロン (PN) から記録された代表的な sEPSC トレース。 スケールバー: 50 pA × 500 ms。 スクランブルまたはPrdm2 KDラットの推定BLA PNから記録されたsEPSCの頻度(C)および振幅(D)を示す累積分布および棒グラフ。 E 誘発された(e)EPSC記録のための記録および刺激電極部位の概略図。 F スクランブルラットまたは Prdm2 KD ラットの推定 BLA PN から記録された、ペアの電気刺激によって誘発された代表的な eEPSC トレース。 スケールバー: 50 pA × 25 ms。 G スクランブルラットまたはPrdm2 KDラットの推定BLA PNから記録されたPPRの平均値を示す棒グラフ。 スクランブルラットまたは Prdm2 KD ラットから記録された eEPSC の 1/CV2 (H) および VMR (I) の平均値を示す棒グラフ (N = 5 ～ 6/グループ)。 *p < 0.05。 J ファイバー測光アプローチを表す概略図 (上) と、BLA をターゲットとした埋め込まれた光ファイバーと、dmPFC 端末をターゲットとする 2 つのウイルス AAV9.HI.shR.ratPrdm2.CMV.ZsGreen.SV40 の発現を示す代表的な画像 (下) BLA および BLA グルタミン酸作動性ニューロンの AAV9.CaMKII.GCaMP6s.WPRE.SV40。 スクランブルラットまたは Prdm2 KD ラットの BLA ニューロンにおける正規化されたカルシウム依存性 GCaMP 蛍光シグナル (平均 ± SEM) を示す K トレース。恐怖表現テストからの最初の 2 トーンの平均。 トーンの長さは、影付きの灰色のボックスで示されます。 トーンの開始 (L) に応答して、より大きなピークの正規化 GCaMP 信号と、トーンに先立つ 5 秒間およびトーン提示の最初の 5 秒間 (M) での正規化 GCaMP 信号の曲線下面積 (AUC) の増加を示す棒グラフ。 Prdm2 KD ラットとスクランブル対照ラットの比較。 BLA扁桃体基底外側、CeA扁桃体中央部、dmPFC背内側前頭前野、LA扁桃体外側扁桃体、VMR分散対平均比、sEPSCの自発的興奮性シナプス後電流。

Prdm2 KDが放出確率に影響を与えるかどうかを調べるために、スクランブルコントロールとPrdm2 KDラットの推定BLA主ニューロンから記録されたeEPSCのペアパルス比（PPR）を電気的に比較しました（図5E、F）。 BLA グルタミン酸作動性入力の放出確率の増加と一致して、スクランブル対照と比較して Prdm2 KD ラットでは PPR が低いことが観察されました (図 5G; スクランブル: 1.39 ± 0.13、n = 19; Prdm2 KD: 1.02 ± 0.07、n = 16) ; p < 0.05、マン・ホイットニー検定）。 さらに、放出確率の変化の独立した尺度を提供するために、eEPSC の変動係数 (1/CV2) と VMR の逆二乗で Prdm2 KD によって誘発される変化を分析しました [46]。 我々は、Prdm2 KD ラットが有意に高い値の 1/CV2 を示すことを発見しました (図 5H; スクランブル: 18.14 ± 4.62、n = 19; Prmd2 KD: 36.46 ± 8.08、n = 16; p < 0.05、マンホイットニー検定)。 VMR はほぼ有意に低い値でした (図 5I; スクランブル: 17.04 ± 3.90、n = 19; Prmd2 KD: 7.91 ± 1.69、n = 16; p = 0.08、マンホイットニー検定)。 機能的小胞放出部位の数の同時変化を除外することはできないが、これらのデータは、dmPFC Prdm2 KD後のBLAへのグルタミン酸作動性入力の放出確率の増加をさらに示唆するPPR結果と一致しているようである。 最後に、本発明者らは、AMPA/NMDA比を測定して、Prdm2 KDがBLA AMPAおよびNMDAグルタミン酸作動性受容体の相対的な機能発現も変化させることができるかどうかを決定した。 Prdm2 KD は AMPA/NMDA 比を変更できませんでした (補足図 5; スクランブル: 2.97 ± 0.60、n = 12; Prmd2 KD: 2.76 ± 0.33、n = 12; p = 0.86、マンホイットニー検定)。 Prdm2 KDに応答してBLAに収束するグルタミン酸作動性シナプスにおけるシナプス後リモデリング。

我々の行動学的および電気生理学的データは、Prdm2 KDが恐怖に関連した合図に対するBLA錐体ニューロンの反応性を高めることによって、条件付き恐怖の発現を増強している可能性があることを示唆しました。 この仮説を検証するために、ファイバー測光法を使用して、恐怖記憶の発現中の BLA ニューロン活動を測定しました (スクランブル: n = 9 および Prdm2 KD n = 13)。 CaMKIIプロモーターの制御下にある蛍光カルシウムセンサーGCaMP6sをコードするAAVベクターを、Prdm2 KDラットおよびスクランブル対照のBLAに一方的に注射し、続いて光ファイバーを移植した（図5J）。 ラットは恐怖条件付けセッションを受け、前と同様に、条件付けされた恐怖の手がかり誘発性発現について24時間後にテストされ、テストセッション中にBLAのカルシウム活性が測定されました。 我々の仮説を裏付けるように、スクランブル対照と比較して、Prdm2 KD ラットにおける恐怖関連緊張の最初の 2 回の提示中に、GCaMP 蛍光のより大きな変化が観察されました（図 5K）。 この効果は、トーンの開始に応答してピーク正規化 GCaMP 信号を測定したとき (図 5L; t(20) = 2.37、p = 0.03) と、正規化 GCaMP 信号の曲線下面積 (AUC) を計算したときの両方で観察されました。トーンの前の 5 秒間とトーン提示の最初の 5 秒間 (図 5M; 治療効果: F(1,20) = 5.28; p = 0.03)。

私たちは、dmPFC-BLA ニューロン経路の制御を介して恐怖記憶の固定化を調節する際のエピジェネティック酵素 PRDM2 の機構的役割を報告します。 われわれは、Prdm2 KD後の恐怖発現の亢進は、神経伝達物質放出に関与する遺伝子の発現増加に起因し、恐怖記憶想起中にグルタミン酸作動性dmPFC-BLA投射ニューロンの活性亢進につながる可能性があることを示す。 まとめると、我々の発見は、dmPFC-BLA 投影が過度の永続的な恐怖反応を促進する可能性がある新しい分子メカニズムを提供します。

実質的な証拠は、恐怖と不安の調節における前頭前皮質-扁桃体回路の役割を支持している[12、13、14]。 ヒトにおける機能画像研究では、健康な人の脅威処理中に dmPFC/前帯状皮質 (ACC) と扁桃体の機能的接続が増加していることが示されています [47]。 全般性不安障害または社会不安障害を持つ個人では、最も重度の症状を有する患者は、最も高い dmPFC/ACC-扁桃体接続性も示しており、この回路がストレスに対する適応的反応だけでなく非適応的反応にも関与していることが示唆されている [48]。 適応ストレス反応における dmPFC/ACC-扁桃体経路の役割と一致して、動物研究では恐怖の発現が dmPFC-BLA 経路の活性化に大きく依存していることが示されています [11]。 条件付けされた恐怖の手がかりは、BLA の dmPFC 興奮性シナプスを強化し [12]、BLA の dmPFC 末端の光遺伝学的サイレンシングは、恐怖の発現と積極的回避の両方を減少させます [13、49]。

我々の発見はこれらの観察と一致しており、非適応的な恐怖反応がどのように生じるのかについての潜在的な分子機構を提供する。 我々は、dmPFC-BLA経路におけるPrdm2 KDが条件付けされた恐怖の発現を増強するのに十分であることを示す。 また、Prdm2 KD が dmPFC-BLA ニューロンの翻訳プロファイルに重大な変化を誘導し、BLA におけるグルタミン酸作動性神経伝達の増加を促進することも発見しました。 具体的には、Prdm2 KD はシナプス形成に関与する 100 個の遺伝子の翻訳プロファイルを改変し、PRDM2 がシナプス機能の調節に重要な役割を果たしていることを示唆しています。 Prdm2 KDは、SNARE複合体（シナプトタグミンおよびシンタキシン）およびN型カルシウムチャネルをコードする遺伝子の発現を増加させた。 さらに、Prdm2 KDは、シナプス伝達とシナプス可塑性に重要な役割を果たすことが知られている細胞接着タンパク質ファミリー（すなわち、ニューレキシン、ニューロリジン、エフリン）に属する遺伝子の発現を増加させた[44、45、50]。 vTRAP アプローチでは、リボソームに関連する (つまり、翻訳中の) mRNA のみが配列決定されることに注意することが重要です。 したがって、mRNAの翻訳はタンパク質レベルとより密接に相関しており、これにより、Prdm2 KD後のmRNA翻訳の変化がニューロン活動に機能的に影響を及ぼし、その結果、恐怖の記憶プロセスに影響を与える可能性が高くなります。 我々のトランスラトミックな発見は、Prdm2 KDがシナプス小胞融合を制御する遺伝子の発現を増加させることによって神経伝達物質の放出を促進することを強く示しています。 この仮説は、スクランブル対照と比較して、Prdm2 KD ラットにおける BLA へのグルタミン酸作動性入力における神経伝達物質放出確率の向上を示すパッチクランプ記録によって裏付けられます。 さらに、Prdm2 KD ラットは恐怖発現中に BLA のニューロン活動の増加を示し、Prdm2 KD が dmPFC-BLA 投影ニューロンのシナプス効果の増加を通じて恐怖発現を増強する可能性があることを示唆しています。

我々のデータはまた、Prdm2 KDが恐怖記憶の固定化（新たに獲得した記憶を安定化させて長期記憶を形成するプロセス）を増加させることによって恐怖表現を増強することを示している[51]。 記憶の固定化の強さは、恐怖反応の個人差に影響を与える可能性があります。 例えば、トラウマ関連記憶の「過剰固定化」は、より強い反応を誘発し、トラウマ関連の病的不安を発症しやすくする可能性がある[52、53]。 恐怖記憶の固定化における Prdm2 の役割と一致して、脳由来神経栄養因子およびサイクリック AMP 応答要素結合タンパク質 1 遺伝子を含む、Prdm2 KD によって調節されるいくつかの遺伝子が恐怖記憶の固定化に関連していることが判明した [54] 、55、56、57]。 さらに、Chen らによる最近の研究では、 [58]は、恐怖記憶の固定化が、SNARE複合体のタンパク質、およびいくつかのニューロリジンおよびニューレキシンをコードする遺伝子の発現増加と関連していることを示した。 プライミング機構にたとえられるものでは、恐怖にさらされる前にこれらの遺伝子の発現が増加すると、その後の恐怖記憶の過剰固定化に寄与する可能性があります。 脳のアルコールへの長期曝露は、dmPFC における Prdm2 発現を下方制御するため [23]、我々の発見はまた、アルコール使用障害を持つ人々における恐怖記憶の病理学的過剰固定化に対する脆弱性の候補となるメカニズムを提供しており、これは高濃度のアルコール使用障害と一致している。 -過剰なアルコール摂取と PTSD の罹患率 [59]。

結論として、我々は、dmPFC-BLA投影ニューロンにおけるPrdm2発現の減少が、BLAにおけるシナプス効率の増加とストレス関連合図に対するdmPFC-BLAニューロン応答の増加を促進する経細胞変化をもたらす、恐怖記憶の固定化の増加に関する新規なメカニズムを提案する。 この研究はまた、ストレス関連障害におけるPRDM2の役割についての最初の一連の証拠を提供する。 最後に、アルコール依存症が dmPFC PRDM2 発現を下方制御するという我々の以前の発見 [23] を考慮すると、アルコール使用と不安障害の広範な併存疾患に対する候補メカニズムが提供されます。

この論文の訂正が公開されました: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01827-w

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vTRAP 実験に関してご協力いただいた K. Meletis 博士に感謝します。 V. Loitto 博士とリンシェーピング大学医学部の中核施設顕微鏡ユニットの技術支援に感謝いたします。 ライブラリーの調製と RNA シーケンスを実行してくれた NGI ストックホルム – SciLifeLab の中核施設に感謝します。 この研究は、スウェーデン研究評議会 (助成金番号 2013–07434)、エステルイェートランド地方、シュティフテルセン プシュキアトリスカ フォルスクニングスフォンデン、ヴァレンベルグ財団、およびクヌート オーク アリス ヴァレンベルグ シュティフテルセ助成金によって資金提供されました。 CC はワレンバーグ分子医学フェローであり、クヌートおよびアリス ワレンバーグ財団から寛大な資金援助を受けています。 著者らは、生物医学的な経済的利益や利益相反の可能性については報告していません。

リンシェーピング大学が提供するオープンアクセス資金。

Riccardo Barchiesi、Kanat Chanthongdee などの著者も同様に貢献しました。

社会感情神経科学センター、リンシェーピング大学生物医学臨床科学部、S-581 85、リンシェーピング、スウェーデン

リッカルド・バルキエージ、カナト・チャントンディー、ミケーレ・ペトレラ、リー・シュー、エシ・ドミ、ガエル・オジェ、アンドレア・コッポラ、ヨースト・ヴィスケルケ、イロナ・シュチョット、エリック・オジェ、マルクス・ハイリグ、エステル・バルビエ

タイ、バンコク、マヒドン大学医学部シリラート病院生理学教室

カナト・チャントンディー

ヴァレンベルク分子医学センター、リンシェーピング大学、リンシェーピング、スウェーデン

サイモン・セーデルホルム & クラウディオ・カントゥ

生物医学および臨床科学部門、分子医学およびウイルス学部門。 リンシェーピング大学医学健康科学部、リンシェーピング、スウェーデン

サイモン・セーデルホルム & クラウディオ・カントゥ

ヨーテボリ大学、サールグレンスカアカデミー、神経科学・生理学研究所、精神医学・神経化学部門、依存症生物学ユニット、ヨーテボリ、スウェーデン

アナ・ドミ＆ルイーズ・アデルマーク

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EB と MH は研究を概念化し、設計しました。 EB は実験を設計および監督し、結果を分析および解釈しました。 RB、KC、EB、EA、GA が行動実験を行いました。 RB、KC、CA、EB が分子解析を実施しました。 EB、ED、RB、LX、MP が手術を行いました。 MP、AD、LA は電気生理学的記録と分析を実施しました。 SS と CC は、RNA 配列データのバイオインフォマティクス分析を実行しました。 JW と IS はファイバー測光データを分析しました。 EB、RB、MH が原稿を作成しました。 すべての著者は原稿を読んで承認しました。

エステル・バルビエへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

この記事のオリジナルのオンライン版は改訂されました: この記事のオリジナル版では、Riccardo Barchiesi、Kanat Chanthongdee、Michele Petrella、Li Xu、Simon Söderholm、Esi Domi、Gaelle Augier、Andrea Coppola、Joost Wiskerke の名と姓が記載されていました。 、Ilona Szczot、Ana Domi、Louise Adermark、Eric Augier、Claudio Cantù、Markus Heilig、Estelle Barbier の構成が間違っていました。 公開時点では、名前はすべてのバージョンで正しく表示されていました。 元の記事は修正されました。

オープン アクセス この記事はクリエイティブ コモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブ コモンズ ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。 この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれています。 素材が記事のクリエイティブ コモンズ ライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。 このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Barchiesi、R.、Chanthongdee、K.、Petrella、M. 他恐怖記憶を過剰に固定化するためのエピジェネティックなメカニズム。 モル精神医学 27、4893–4904 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41380-022-01758-6

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受信日: 2021 年 12 月 17 日

改訂日: 2022 年 8 月 9 日

受理日: 2022 年 8 月 18 日

公開日: 2022 年 9 月 21 日

発行日：2022年12月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01758-6

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