社会認識記憶のノルアドレナリン作動性固定はβによって媒介される

May 27, 2023

Communications Biology volume 5、記事番号: 1097 (2022) この記事を引用

1653 アクセス

5 オルトメトリック

メトリクスの詳細

社会認識記憶 (SRM) は、社会関係を維持し、生存率を高めるために重要です。 内側前頭前皮質 (mPFC) は、SRM 記憶に関連する重要な脳領域です。 ノルエピネフリン（NE）放出は、mPFC ニューロンの固有興奮性と興奮性シナプス伝達を制御しますが、SRM 保存中の mPFC への青斑核（LC）経路の回路における NE シグナル伝達の役割は不明です。 ここで、LC-mPFC NE 投影が双方向に制御された SRM 統合を発見しました。 プロプラノロール注入と mPFC における β-アドレナリン受容体 (β-AR) または β-アレスチン 2 ノックアウトは、SRM の強化を破壊しました。 β-アレスチンに偏ったシグナル伝達を穏やかに活性化できるβブロッカーであるカルベジロールを注射した場合、マウスはSRMの強化の有意な抑制を示さなかった。 mPFC における β1-AR または β-アレスチン 2 ノックアウトによって引き起こされる SRM 強化障害は、LC-mPFC NE 投影の活性化によって回復されませんでした。 しかし、mPFCにおけるLC-mPFC NE投影の阻害またはβ1-ARノックアウトによって損なわれたSRMは、mPFCにおけるβ-アレスチンシグナル伝達経路を活性化することによって回復した。 さらに、β-アレスチンシグナル伝達の活性化により、高齢マウスのSRMの強化が改善されました。 我々の研究は、LC-mPFC NE 投影が、β-アレスチンに偏った β-AR シグナル伝達を介して SRM の強化を調節していることを示唆しています。

社会認識記憶 (SRM) は、環境への適応、生殖、生存に不可欠な社会的関係 1 を確立および維持するために重要です 2,3。 げっ歯類では、SRM は、以前に遭遇したよく知られた同種よりも新しい同種を区別して好む能力によって評価されます。 他の形式の学習と同様に、不安定な痕跡が長期記憶に安定化されると、社会情報が獲得され、統合されます4。 SRM 統合の基礎となるメカニズムは不明です。

内側前頭前野（mPFC）は、幅広い社会的行動にとって重要です1,5。 mPFC は、腹側海馬 – mPFC、扁桃体 – mPFC、嗅覚 – mPFC 回路など、社会的記憶に重要ないくつかの神経回路に含まれています 6、7、8。 NMDA または AMPA/カイニン酸受容体アンタゴニストを mPFC に注入すると、SRM の固定化が防止されます9。 この証拠は、mPFC におけるグルタミン酸作動性シナプス伝達が社会的能力と社会的認識記憶を調節していることを示唆しています。 mPFC のニューロンの興奮性も社会的記憶にとって重要です。 mPFC の興奮性ニューロンは、社会的探索に向けて調整された個別のアンサンブルを形成し、社会的ターゲットに関する情報を伝達します10。 mPFC の興奮性ニューロンが活性化すると、社会的探索が減少します 11。 Shank3 欠損マウスにおける mPFC 興奮性ニューロンの化学遺伝学的活性化により、社会的認識の低下が回復します 12。 mPFC におけるタンパク質合成は SRM の強化に必要ですが、社会的認知には必要ではありません 13。 ノルエピネフリン (NE) は、注意、知覚、認知において重要な役割を果たす一般的な神経調節物質です 14。 中枢神経系における NE の主な発生源である青斑核 (LC) のノルアドレナリン ニューロンは、高度に分枝した軸索樹枝形成を通じて mPFC を含む前脳に広く投射します 15,16。 パッチクランプ記録では、NE の放出により mPFC ニューロンの固有興奮性が増強され 17、β-アドレナリン受容体 (β-AR) アンタゴニストによって遮断されることが示されています 18。 β-AR の活性化は、mPFC19 の錐体ニューロン上の興奮性シナプスのシナプス後反応も促進します。 ただし、LC-mPFC NE システムが SRM に関与しているかどうか、また mPFC の NE シグナリングが SRM 統合にどのように寄与するかは不明のままです。

β-AR は、NE に応答する典型的なヘテロ三量体グアニンヌクレオチド結合タンパク質 (G タンパク質) 共役受容体 (GPCR) です。 リガンド結合は、ヘテロ三量体 G タンパク質を動員する GPCR 構造変化を誘導し、アデニル酸シクラーゼの活性化を引き起こします。 さらに、GPCR のリガンド依存性リン酸化は β-アレスチンの動員を促進し、受容体の脱感作を誘導します 20。 さらに、β-アレスチンは足場タンパク質として機能し、G タンパク質とは独立してシグナル伝達経路を開始します 21。 我々の以前の研究は、嗅内皮質におけるβ-AR/β-アレスチンに偏ったシグナル伝達が物体認識記憶の再固定を媒介することを示した22。 しかし、社会的記憶における G タンパク質と β-アレスチンに偏った β-AR シグナル伝達の寄与は、依然としてほとんど知られていない。

上記の考察を考慮して、本研究は、SRM の強化における LC-mPFC ノルアドレナリン作動性投射と β-AR およびそれらの下流シグナル伝達経路の役割に焦点を当てました。

社会的記憶記憶に対する LC-mPFC NE 投影の影響を決定するために、十分に検証された 3 室の社会的認識記憶タスクを適用しました 23。 TH-CreマウスのLC NEニューロンでeNpHR3.0-EYFPまたはChR2-mCherryを発現させ、mPFCのNE末端を検出しました（EYFP+またはmCherry+、図1a、b、g、h）。 mPFC における eNpHR3.0+ NE 末端 24 の光遺伝学的阻害は NE 放出を大幅に減少させましたが、mPFC における ChrimsonR+ NE 末端 24 の光遺伝学的活性化は NE 放出を大幅に増加させました（補足図 1a-d）。 3 つのチャンバーからなる装置への最初の曝露を含む馴化セッションでは、すべてのマウスが外側の 2 つのチャンバーに対して同様の好みを示しました。 訓練段階（社交性テスト）中、マウスは空のワイヤーケージ（E）上で新しいマウス（N）との対話に大幅に長い時間を費やしました（補足図1e、f）。これは、2つのグループ間で同様の社交性があることを示唆しています。 社交性テストの直後に、LC-mPFC NE投影を選択的に刺激しました（図1a、g）。 SRM テストは、マウスを新規マウスに曝露してから 1 時間または 1 日後に実施され、現在馴染みのあるマウス (F) との相互作用時間と 2 番目の新規マウス (N) との相互作用を比較することが含まれていました。 LC-mPFC NE 投影の光遺伝学的阻害 25 は、SRM テスト 1 における新規マウスの優先性を変化させませんでした (図 1c、d)。 ただし、SRMテスト2の識別指数は減少しました（図1e、f）。これは、LC-mPFC NE予測は長期SRMには必要ですが、短期SRMには必要ではないことを示唆しています。 さらに、3腔SRMタスクでは、訓練後のLC-mPFC NE投影の光遺伝学的活性化は、1日後に行われたSRMテストでの新規マウスの探索を増加させないことがわかりました（図1i、j）。 SRM は急速に消失し、マウスでは数日間しか持続しません 26。 訓練の4日後にSRMテストを行ったところ、対照マウスは新規マウスと慣れ親しんだマウスをほぼ同等に探索したが、LC-mPFC NE投影が活性化したマウスは対照群よりも新規マウスに対してかなり強い選好を示した(図1k、l）は、mPFCにおけるNE放出の強化が社会的記憶の維持を延長し、SRMの固定化を促進したことを示唆しています。 β アドレナリン受容体の活性化により細胞外シグナル調節キナーゼ (ERK) が動員され、長期増強の維持と長期記憶の形成が促進されます 27。 そこで、レーザー刺激による社交性テスト後の mPFC における pERK レベルを調べました。 新しいマウスへの曝露は、使い慣れたマウスまたは空のワイヤーケージへの曝露と比較して、mPFCのpERKレベルが大幅に増加することを発見しました（補足図2）。 さらに、LC-mPFC NE投影の阻害は、社交性テスト後のmPFCにおけるERK活性化を抑制しました（図1m、n）。 LC-mPFC NE 投影の活性化は、ナイーブマウスの mPFC における ERK 活性化を増加させましたが、社交性テスト後は ERK 活性化をさらに促進しませんでした (図 1m、o)。 これらの発見は、LC-mPFC NE 投影が ERK 活性化などのアドレナリン作動性下流シグナル伝達を介して SRM の強化を調節している可能性があることを示しています。

a、g 実験計画。 AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP または AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherry を TH-Cre マウスの LC に注射し、mPFC 上に光ファイバーを両側に移植しました。 LC-mPFC NE 投影はトレーニング後に光学的に刺激され、SRM テストはトレーニングの 1 時間後、1 日後、または 4 日後に実行されました。 社交性テストの後に、レーザー（590 nm、10 mW、10 分間連続、473 nm、5 mW、25 Hz で 5 ms パルスを 20 回、5 秒ごとに 5 分間）を照射しました。 b、h TH免疫染色およびmPFCの光ファイバーチップを備えたLCにおけるeNpHR3.0-EYFP（b）またはChR2-mCherry（h）発現の代表的な画像。 c、e、i、k SRM テストのヒート マップ。 d、f、j、l 既知マウス (F) および新規マウス (N) の探索時間と識別スコアの統計グラフ [EYFP: n = 12、eNPHR3.0: n = 12。 d 左: F マウス × ウイルス ( 1、22) = 1.628、p = 0.215、二元配置 RM 分散分析。 右: Z = 70.000、p = 0.931、マン・ホイットニー U 検定。 f 左: F マウス × ウイルス (1, 22) = 9.398、p = 0.006、二元配置 RM ANOVA。 右: t (22) = 3.807、p < 0.001、両側スチューデント t 検定。 mCherry: n = 14、ChR2: n = 12。 j 左: F マウス × ウイルス (1、24) = 1.860、p = 0.185、二元配置 RM ANOVA。 右: t (24) = −1.664、p = 0.113、両側スチューデント t 検定。 l 左: F マウス × ウイルス (1, 24) = 11.904、p = 0.002、二元配置 RM ANOVA。 右: t (24) = −3.983、p < 0.001、両側スチューデント t 検定]。 m 実験計画。 AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP または AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherry を TH-Cre マウスの LC に注射しました。 LC-mPFC NE 投影は社交性テスト後に光学的に刺激されました。 社交性テストの 15 分後に、mPFC の pERK レベルを検査しました。 n 社交性テスト後のLC-mPFC NE投影の阻害によるmPFC内のpERKレベルの代表的なウェスタンブロットおよび棒グラフ[各グループのn = 7。 F セッション × ウイルス (1, 24) = 6.863、p = 0.015、二元配置分散分析]。 o 社交性テスト後のLC-mPFC NE投影の活性化を伴うmPFC内のpERKレベルの代表的なウェスタンブロットおよび棒グラフ[各グループのn = 5。 F セッション × ウイルス (1, 16) = 2.807、p = 0.113、二元配置分散分析]。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、および ###p < 0.001 対示されたグループ。 スケールバー: 100 μm。

AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCreをAdrb1fl / flまたはAdrb2fl / flマウスのmPFCに注射することにより、mPFCグルタミン酸作動性ニューロンのAdrb1またはAdrb2を選択的にノックアウトしました（図2a〜f）。 3腔SRMタスクでは、mPFCのβ1-ARが半分または完全に欠失しているマウスは、SRMテストにおいて新規マウスに対する優先度の低下を示しました（図2g–i）。一方、完全に欠失しているマウスはそうではありませんが、 mPFCにおけるβ2-ARの半分の欠失は、SRMテストにおいて新規マウスに対する優先度の低下を示した（図2j）。 すべてのマウスは、社交性テスト中に空のケージよりも新しいマウスを好みました（補足図3a、b）。これは、mPFCのβ1-ARおよびβ2-ARの欠失が社交性を損なわないことを示唆しています。 mPFCにおけるβ1-ARの選択的ノックアウトは、運動活動に影響を与えなかった（補足図3c）。 ただし、中央エリアの距離が減少したことからわかるように、不安レベルは増加しました。また、オープンフィールドタスク中に中央エリアで過ごす時間と、L / Dボックスタスク中にライトサイドで過ごす時間が減少しました（補足図3d-） h)。 mPFCにおけるβ2-ARの選択的ノックアウトは、運動量や不安レベルに大きな影響を与えませんでした（補足図3i-n）。 これらの結果は、mPFC の β1-AR または β2-AR ノックアウトマウスは社会的記憶を示すことができないことを示し、mPFC の β-AR 発現が SRM の固定化に必要であることを示しました。

a、d AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCreを、Adrb1fl/flまたはAdrb2fl/flマウスおよびそのWT同腹子のmPFCに注射した。 b、e、c、f FISH による mPFC の adrb1 および adrb2 mRNA レベルの代表的な画像と統計グラフ。 [c WT: n = 4 (3729 細胞)、Adrb1fl/fl: n = 4 (3503 細胞)、t (6) = 31.54、p < 0.001、両側スチューデント t 検定。 f WT: n = 4 (3192 細胞)、Adrb2fl/fl: n = 4 (3538 細胞)、t (6) = 3.543、p = 0.012、両側スチューデント t 検定]。 スケールバー: 50 μm。 g 実験計画。 AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCreを、Adrb1fl/flまたはAdrb2fl/flマウス、およびそれらのWTおよびヘテロ接合体の同腹子のmPFCに注射した。 4 週間後、SRM タスクが実行されました。 h mPFC における Cre-EGFP 発現の代表的な画像。 スケールバー: 500 μm。 i、j 既知マウス（F）および新規マウス（N）の探索時間と、mPFCにAdrb1またはAdrb2ノックアウトを有するマウスの識別スコアの統計グラフ。 [i WT: n = 13、Adrb1fl/+: n = 10、Adrb1fl/fl: n = 11。F マウス × 遺伝子型 (2, 31) = 4.085、p = 0.027、二元配置 RM ANOVA; 右: F (2, 31) = 5.364、p = 0.01、一元配置分散分析。 j WT: n = 15、Adrb2fl/+: n = 12、Adrb2fl/fl: n = 11。左: F マウス × 遺伝子型 (2, 35) = 4.433、p = 0.019、二元配置 RM 分散分析、右: F (2, 35) = 4.139、p = 0.024、一元配置分散分析]。 *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001 対示されたグループ。

上記の結果に従って、SRM の強化に対する非選択的 β-AR アンタゴニストのプロプラノロールとカルベジロールの効果をテストしました。 社交性テストの直後にプロプラノロールをmPFCに両側から注入すると、長期的なSRMは大幅に損なわれました（図3a〜c）が、短期的なSRMは無傷のままでした（補足図4a〜c）。 さらに、トレーニング後のmPFCへのプロプラノロール注入は、恐怖条件付けの記憶の固定を妨げませんでした（補足図5）。 プロプラノロールの効果とは対照的に、Gタンパク質に偏ったβ-ARアンタゴニストであるカルベジロール28、29、30はSRMの固定化に影響を与えず（図3d）、これはSRMの固定化がGタンパク質経路に依存しない可能性を示唆している。 SRMタスクでは、すべてのマウスが社交性テスト中に空のケージよりも新しいマウスを著しく好むことを示しました（補足図4b、d）。 これらのデータは、mPFC における β-AR 活性化が SRM の固定化に選択的に関与していること、およびこの記憶プロセスには G タンパク質非依存性のシグナル伝達が必要である可能性があることを示唆しています。

実験的な計画。 β-AR アンタゴニストであるプロプラノロール (10 μg) またはカルベジロール (5 μg) をトレーニング直後に注入し、1 日後に SRM テストを実施しました。 b mPFC へのカニューレ移植の代表的な画像。 スケールバー: 500 μm。 c、d 既知マウス（F）および新規マウス（N）の探索時間と識別スコアの統計グラフ [c、ビヒクル：n = 15、プロプラノロール：n = 13。左：F マウス × 治療（1、26） = 6.906、p = 0.014、二元配置RM ANOVA。 右: t (26) = 3.507、p = 0.002、両側スチューデント t 検定。 d ビヒクル: n = 12、カルベジロール: n = 14。左: F マウス × 治療 (1、24) = 2.707、p = 0.113、二元配置 RM ANOVA。 右: t (24) = −1.477、p = 0.153、両側スチューデント t 検定]。 e mPFCにおけるCre-EGFP発現の代表的な画像。 AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCreを、Arrb2fl/flマウスおよびそのWT同腹子のmPFCに注射した。 スケールバー: 100 μm。 f Arrb2 mRNA 相対発現レベルの棒グラフ。 Arrb2fl/fl マウスおよびその WT 同腹子の mPFC に AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre を注射してから 4 週間後 [各群 n = 7、t (12) = 4.515、p < 0.001、対応のない両側 t 検定] 。 g β-アレスチン2ノックアウトを有するmPFCにおけるpERKレベルの代表的なウェスタンブロットおよび棒グラフ[各グループのn = 5。 F マウス × セッション (1, 16) = 11.556、p = 0.004、二元配置分散分析]。 h 既知マウス (F) および新規マウス (N) の探索時間と識別スコアの統計グラフ。 [WT: n = 12、Arrb2fl/fl: n = 15。左: F マウス × 遺伝子型 (1、25) = 7.094、p = 0.013、二元配置 RM 分散分析。 右: t (25) = 2.557、p = 0.017、対応のない両側 t 検定]。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、および ##p < 0.01 対示されたグループ。

我々は、mPFC における β-アレスチンシグナル伝達経路が SRM の固定化に関与している可能性があると提案します。 この仮説を検証するために、AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCreをArrb2fl / flマウスのmPFCに注射し、mPFC興奮性ニューロンのβ-アレスチン2を選択的にノックアウトしました（図3e、f）。 mPFCのβ-アレスチン2選択的ノックアウトは、社交性、不安レベル、または運動活動に影響を与えることなく、見慣れたマウスよりも新しいマウスの好みを大幅に減少させました（図3hおよび補足図6a〜g）。これは、mPFCにおけるβ-アレスチン2発現がSRM の統合には mPFC が必要です。 GPCR の下流にある β-アレスチンはシグナル伝達物質として機能し、ERK 活性化を含むさまざまなシグナル伝達および細胞応答の活性化を媒介します 30、31、32。 そこで、社交性テスト後の野生型（WT）マウスとβ-アレスチン2ノックアウトマウスのmPFCにおけるERK活性化を調べました。 結果は、社交性テストにより、WT同腹子のmPFCにおけるpERKレベルが有意に増加したが、β-アレスチン2 mPFCノックアウトマウスでは増加しなかったことが示された（図3g）。 これらの結果は、β-アレスチンを介したシグナル伝達経路が SRM の固定化において重要な役割を果たしていることを示しています。

SRM の NE 作動性固定化が mPFC の β-AR および β-アレスチンに偏ったシグナル伝達経路によって媒介されることを確認するために、β1-AR および β-アレスチン 2 mPFC ノックアウト マウスを用いて、LC NE 末端を光学的に刺激して SRM タスクを実行しました。 mPFC (図 4a、b)。 mPFCにおけるβ1-AR選択的ノックアウトはSRMの強化を損なったが、LC-mPFC NE投影の光遺伝学的活性化によっては回復されなかった（図4c）。 さらに、mPFCにおける選択的β-アレスチン2欠失による損なわれたSRM統合は、LC-mPFC NE投影の活性化によって回復されませんでした（図4e）。 さらに、LC-mPFC NE 投影が活性化された WT マウスは、対照群のマウスよりも新規マウスに対して持続的に高い選好性を示しましたが、mPFC の β1-AR または β-アレスチン 2 が欠失したマウスは、新規マウスの識別障害を示しました。 LC-mPFC NE投影の活性化があっても、訓練4日後の新規マウス（図4d、f）。

実験的な計画。 AAV9-EF1α-DIO-ChR2-mCherryおよびAAV9-THP-iCreをLCに注入し、AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCreをmPFCに注入し、Adrb1fl/flまたはArrb2flのmPFC上に光ファイバーを移植しました。 /fl マウス。 4 週間後、SRM タスクが実行されました。 mPFC の NE 終末を刺激するために、社交性テストの後に青色光を照射し (473 nm、25 Hz で 5 ミリ秒のパルスを 20 回、5 秒ごと、5 分間継続)、1 日後に SRM テストを実施しました。 b LCにおけるChR2-mCherry発現、Cre-EGFP発現、ChR2-mCherry+末端、およびmPFCにおける光ファイバー先端の代表的な画像。 c – f 既知マウス（F）および新規マウス（N）の探索時間と識別スコアの統計グラフ[c、d mCherry / EGFP、n = 12。 ChR2/EGFP、n = 11; ChR2/Cre、n = 13; mCherry/Cre、n = 12。c 左: F マウス × ウイルス (3, 44) = 7.961、p < 0.001、二元配置 RM ANOVA。 右: F (3, 44) = 4.139、p < 0.001、一元配置分散分析。 d 左: F マウス × ウイルス (3, 44) = 5.895、p = 0.004、二元配置 RM ANOVA。 右: F (3, 44) = 8.928、p < 0.001、一元配置分散分析。 e、f mCherry/EGFP、n = 12; ChR2/EGFP、n = 13; ChR2/Cre、n = 13; mCherry/Cre、n = 12。 e 左: F マウス × ウイルス (3, 46) = 7.304、p < 0.001、二元配置 RM ANOVA。 右: F (3, 46) = 7.469、p < 0.001、一元配置分散分析。 f 左: F マウス × ウイルス (3, 46) = 10.826、p < 0.001、二元配置 RM ANOVA。 右: F (3, 46) = 9.586、p < 0.001、一元配置分散分析]。 g scAAV1-hSyn-FlpOをLCに注射し、AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherryをArrb2fl/flマウスのmPFCに注射した。 mPFC における Cre-mCherry 発現の代表的な画像。 h 既知マウス (F) および新規マウス (N) の探索時間と識別スコアの統計グラフ [WT: n = 11; Arrb2fl/fl: n = 15。左: F マウス × ウイルス (1, 24) = 4.7、p = 0.04、二元配置 RM ANOVA、右: t (24) = 2.196、p = 0.038、両側スチューデント tテスト]。 *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001 対示されたグループ。 スケールバー: 100 μm。

研究では、高力価の AAV1 が順行性シナプス経由拡散を示すことが示されています 33。 Cre/FlpO リコンビナーゼ発現 AAV1 をシナプス前ニューロンを含む脳領域に注射し、同時に Cre/FlpO 誘導性発現カセットを含む AAV を下流領域に注射すると、シナプス前領域によって神経支配されるシナプス後ニューロンの選択的標識が可能になります 34,35。 次に、高力価の前向性 scAAV1-hSyn-FlpO を LC に注射し、AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherry を Arrb2fl/fl マウスの mPFC に注射しました。これにより、Cre リコンビナーゼが発現し、mPFC で β-アレスチン 2 がノックアウトされました。 LC アドレナリン作動性ニューロンおよび非アドレナリン作動性ニューロンによって神経支配されるニューロン (図 4g)。 選択的β-アレスチン2欠失を有するマウスは、新規マウスに対する優先度の低下を示し、LC-mPFC回路におけるβ-アレスチン2発現がSRMの固定化に必要であることを示唆している（図4h）。 すべてのマウスは無傷の社交性を示しました（補足図7）。 上記の結果は、SRM 固定中の LC-mPFC NE 放出の調節が、β-アレスチンに偏った β-アドレナリン作動性シグナル伝達によって媒介されることを示しています。

我々は、アデノ随伴ウイルスベクターを開発し、R165L 変異体 rM3Dq (rM3Darr)36 を mPFC に送達し、CNO 処理により β-アレスチン依存性シグナル伝達を薬理学的に活性化しました。 我々はまず、rM3DarrをトランスフェクトしたN2a細胞におけるβ-アレスチン依存性シグナル伝達の活性化を確認した。 結果は、CNO（1μM）が処理後15〜30分でpERKレベルを有意に増加させることを示しました（図5a）。 さらに、β-アレスチン2ノックダウンは、rM3Darr発現のあるN2a細胞におけるCNO処理（1μM）によって誘導されるERK活性化を阻害し（図5b）、rM3Darr活性化がβ-アレスチン依存性ERK活性化を誘導することが示唆されました。 次に、mPFCでrM3Darr-mCherryを発現させ、3チャンバーSRM実験を実行しました（図5c、d）。 社交性テストの直後に CNO (1 mg/kg、腹腔内) で処置したマウスは、1 日後に行われた SRM テスト中に新規マウスに対するさらなる嗜好の増加を示さなかった。 しかし、4日後に実施されたSRMテスト中に新規マウスに対する持続的な選好を示し（図5e、f）、β-アレスチン2シグナル伝達の活性化がSRMの強化を促進することを示唆しています。 次に、mPFCでrM3Darr-mCherryを、LC NEニューロンでeNpHR3.0-EYFPを発現させ、mPFCに光ファイバーを移植しました（図5g）。 LC-mPFC NE投影の光遺伝学的阻害は新規マウスへの選好を減少させたが、β-アレスチンシグナル伝達の活性化は新規マウスへの選好を有意に高めた（図5h）。これは、β-アレスチンシグナル伝達経路の活性化が社会的障害を回復させることを示唆している。 LC-mPFC NE 投影の阻害によって引き起こされるメモリ。 さらに、rM3Darr-mCherryを同時に発現させ、mPFCのβ1-ARを削除しました（図5i）。 SRMの固定化はmPFCのβ1-AR欠失によって損なわれましたが、β-アレスチンシグナル伝達経路の活性化により、慣れ親しんだマウスに対する記憶が回復し、新規マウスに対する嗜好性が増加しました（図5j）。 すべてのマウスは、社交性テスト中に空のケージよりも新しいマウスを好みました（補足図8）。 これらの結果は、SRM の固定化が、β-アレスチンに偏ったシグナル伝達の薬理学的活性化によって促進される可能性があることを示唆しています。

a CNO (1 μM) は、rM3Darr でトランスフェクトされた N2a 細胞において、処理後 15 ～ 30 分で pERK レベルを有意に増加させました [各グループの n = 7、15 分: F (5, 36) = 5.261、p < 0.001、一方向分散分析]。 b Arrb2 ノックダウンは、rM3Darr でトランスフェクトされた N2a 細胞における CNO 処理 (1 μM) による ERK 活性化を 15 分で阻害しました [各グループの n = 6、F shRNA × 処理 (1、20) = 8.207、p = 0.010、二元配置分散分析]。 c 実験計画。 AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry および AAV9-CAG-Cre を C57BL/6 J マウスの mPFC に注射しました。 4 週間後、SRM タスクが実行されました。 訓練後にマウスにCNO(1mg/kg、腹腔内)を注射し、1日後と4日後にSRM試験を行った。 d mPFCにおけるrM3Darr-mCherry発現の代表的な画像。 e、f 既知マウス（F）および新規マウス（N）の探索時間と識別スコアの統計グラフ[生理食塩水、n = 13。 CNO、n = 15。e 左:F マウス × 治療 (1、26) = 2.29、p = 0.142、二元配置 RM ANOVA。 右: t (26) = −1.121、p = 0.273、両側スチューデント t 検定。 f 左: F マウス × 治療 (1、26) = 7.024、p = 0.014、二元配置 RM ANOVA。 右: t (26) = −2.579、p = 0.016、両側スチューデント t 検定]。 g ウイルス注入および LC における eNpHR3.0-EYFP 発現、rM3Darr-mCherry 発現および mPFC における光ファイバー先端の代表的な画像。 AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFPをLCに注射し、AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherryおよびAAV9-CAG-CreをTH-CreマウスのmPFCに注射した。 光ファイバーを mPFC の上に埋め込みました。 h 既知マウス (F) および新規マウス (N) の探索時間と識別スコアの統計グラフ [EYFP/mCherry、n = 13; EYFP/rM3Darr、n = 12; eNpHR3.0/rM3Darr、n = 14; eNpHR3.0/mCherry、n = 13。左: F マウス × ウイルス (3, 48) = 7.135、p < 0.001、二元配置 RM ANOVA、右: F (3, 48) = 8.697、p < 0.001、1 -way ANOVA]。 i ウイルス注入と、mPFC における rM3Darr-mCherry および Cre-EGFP 発現の代表的な画像。 j 探索時間と識別スコアの統計グラフ [生理食塩水、n = 12; CNO、n = 15。左: F マウス × 治療 (1, 25) = 9.238、p = 0.005、二元配置 RM ANOVA。 右: t (25) = −3.638、p = 0.001、両側スチューデント t 検定]。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、および ###p < 0.001 対示されたグループ。 スケールバー: 100 μm。

宣言学習と記憶の能力の低下は、加齢に伴ってよく見られます37。 我々の結果は、SRMの強化が高齢マウス（>18か月齢、図6a、b）で損なわれていることを示しています。 したがって、高齢マウスのmPFCでrM3Darr-mCherryを発現させました（図6c）。 データは、社交性テスト後のCNO（1 mg/kg、腹腔内）処置が、SRMテストにおける新規マウスに対する選好を有意に増加させたことを示した（図6d）。 すべてのマウスは、社交性テスト中に空のケージよりも新しいマウスを好みました（補足図9）。 これらのデータは、β-AR/β-アレスチンに偏ったシグナル伝達が、高齢者の社会的記憶を改善するための潜在的な薬物標的である可能性があることを示唆しています。

実験的な計画。 SRM タスクは高齢マウス (>18 か月齢) で実行されました。 b 探索時間と識別スコアの統計グラフ [若年成人、n = 12。 高齢者、n = 11。左: F マウス × 年齢 (1、21) = 9.816、p = 0.005、二元配置 RM ANOVA。 右: Z = 33.000、p = 0.045、マン・ホイットニー U 検定]。 c mPFC における rM3Darr-mCherry 発現の代表的な画像。 AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry および AAV9-CAG-Cre を高齢マウス (>18 か月齢) の mPFC に注射しました。 d 既知マウス (F) および新規マウス (N) の探索時間と識別スコアの統計グラフ [生理食塩水、n = 11。 CNO、n = 12。左: F マウス × 治療 (1, 21) = 4.979、p = 0.037、二元配置 RM ANOVA、右: t (21) = −2.95、p = 0.008、両側スチューデント t 検定]。 e LC-mPFC NE投影が、β-アレスチン2に偏ったシグナル伝達を通じて社会的認識の記憶の固定化を調節することを示す作業モデル。 *p < 0.05、**p < 0.01、および ***p < 0.001 対示されたグループ。 スケールバー: 100 μm。

この研究では、LC-mPFC NE投影が、mPFCにおけるβ-AR / β-アレスチンに偏ったシグナル伝達を介してSRMの強化を制御することを発見しました（図6e）。 LC-mPFC NE 投影または β-アレスチンシグナル伝達の活性化は、社会的記憶の維持を促進しました。 さらに、mPFC における NE 投影阻害または β1-AR 欠失によって引き起こされる SRM 強化の障害は、β-アレスチンに偏ったシグナル伝達を活性化することによって回復しました。

3 室タスクは、社交性と社会的記憶を定量的に測定するために広く使用されているテスト パラダイムです 38,39。 マウスは 3 つの部屋のうちの 1 つに入ることを選択します。 したがって、社交性は、新しいマウスの好みと空の有線ケージの好みを直接比較することによって測定できる可能性があります。 このタスクでは、各チャンバー内で新しいマウスとの相互作用をおなじみのマウスとの相互作用と比較することによって、社会的認識記憶を評価することもできます。 しかし、マウスが社会的な新奇性を好むのか、それともワイヤーで囲まれたケージ内での新奇性だけを好むのかは不明のままです。 マウスは、以前は空だったケージに何かまたは新しいマウスが入っていることだけを気にしている可能性があります。

私たちのデータは、β-アドレナリン作動性アンタゴニストであるプロプラノロールを注射するか、mPFCのβ-ARをノックアウトすると、SRMの強化が著しく損なわれる一方、非選択的β-AR Gタンパク質に偏ったアンタゴニストおよびα1-ARアンタゴニストであるカルベジロールを注射すると、SRMの強化が誘導されることを示しました。そのような障害はありません。 プロプラノロールとカルベジロールの異なる効果は、mPFC 内の β-AR が SRM 強化のプロセスに関与しているが、α1-AR は関与していないことを示唆しています。 多くの研究は、mPFC の α2-AR が作業記憶に関与していることを示しており、異なる結論に達しています。 いくつかの研究では、α2-AR の活性化が作業記憶のパフォーマンスなどの mPFC 機能を損なうことが報告されています 37,40。 しかし、他の研究では、α2 アドレナリン作動薬が作業記憶を含む前頭前皮質の機能を改善することが報告されています 41,42。 さらに、α2 アドレナリン拮抗薬（NE 濃度を上昇させる）の投与は社会的認識を改善することが示されています 43。 錐体ニューロンと介在ニューロンではαおよびβアドレナリン受容体の発現が異なるため、社会認識記憶の固定におけるmPFCにおけるα-ARとβ-ARの異なる役割をさらに研究する必要がある。

リガンドが結合すると、β-AR を含む G タンパク質共役受容体 (GPCR) は構造変化を起こし、ヘテロ三量体 G タンパク質および β-アレスチンへの結合を促進します。 最近の研究では、ヘテロ三量体 G タンパク質と β-アレスチンが両方とも独立して細胞内シグナル伝達分子と相互作用し、細胞内シグナル伝達分子を動員できることが示されています 44,45。 GPCR に結合するほとんどのリガンドは、G タンパク質と β-アレスチンを介してバランスの取れた、または偏りのないシグナル伝達活性を持っています。 他の経路よりも 1 つの経路を優先するいくつかのリガンドも発見されています。 カルベジロールは、β-アレスチンシグナル伝達を穏やかに活性化する、G タンパク質に偏った β-AR アンタゴニストです。 プロプラノロールは、G タンパク質経路と β-アレスチン経路の両方をブロックする完全なアンタゴニストです。 これまでの研究では、カルベジロールが Gαi の β1-AR への動員を選択的に促進し、β-アレスチン 2 偏向経路 28,46 を活性化し、β1-AR を介した EGFR のトランス活性化と β-アレスチン 2 依存性 ERK 活性化 30 を誘導することが示されており、β -arrestin2 は、β1-AR シグナル伝達を独立して仲介できます。 従来の G タンパク質/cAMP/PKA シグナル伝達経路が記憶における β-AR の役割を媒介すると長い間考えられてきました。 これまでの研究では、プロプラノロールでβ-AR伝達を遮断すると、恐怖条件付け、物体認識、コカイン誘発CPP時の記憶の固定化または再固定化が損なわれることが示されている42,47,48。 PKA や CREB ​​などの G タンパク質共役経路の特定の構成要素の活性が阻害されると、記憶の固定と再固定が混乱します 49,50。 ただし、記憶の再固定にはタンパク質合成が必要ですが、PKA の活性化は必要ありません51。 我々のこれまでの研究は、嗅内皮質におけるβ-アレスチンに偏ったシグナル伝達が物体認識記憶の再固定を媒介することを示唆しており 22 、β-アレスチン依存性シグナル伝達経路が記憶記憶に役割を果たしているはずであることを示唆している。 この研究では、カルベジロールは記憶保持テスト1においてSRMを抑制しなかったが、プロプラノロールは抑制したことから、トレーニング後のSRMの強化はGタンパク質に偏った経路に依存しない可能性があることが示唆された。 さらに、mPFC に β-アレスチン 2 がノックアウトされたマウスでは、SRM の強化が損なわれていました。 トレーニング後にβ-アレスチンシグナル伝達経路が活性化されると、SRMの維持が促進され、LC-mPFC投影の阻害やβ1-ARの欠失によって引き起こされるSRMの固定化障害が回復した。 したがって、LC-mPFC NE 投影の調節が、mPFC における β-アレスチンに偏ったシグナル伝達経路を介して SRM の強化を調節する可能性があると我々は提案します。

これまでの研究では、老化した動物は、明らかな認知機能の低下がないにもかかわらず、社会的課題中に新しい若いマウスとの相互作用レベルが大幅に低下することが示されており 52,53 、これは社会回路が老化中に特に脆弱であることを示唆しています。 LC ニューロンは、高齢者 54 や動物では若い個体 55 よりも大幅に減少していることが長い間報告されており、これが高齢マウスの社会的記憶の問題に寄与している可能性があります。 この研究では、mPFCのrM3Darr発現ニューロンを刺激することによるβ-アレスチンシグナル伝達の直接活性化が、高齢マウスの優先的探索を大幅に増加させることを発見しました。 したがって、我々の研究は、β-アレスチンに偏ったシグナル伝達がSRMの貯蔵にとって重要であることを実証している。

GPCR 下流シグナル伝達におけるリガンドバイアスの概念は、最近ますます注目を集めています。 アンジオテンシン II 1 型受容体の β-アレスチンに偏ったリガンド (AT1R)56、μ-オピオイド受容体 (MOR) の G タンパク質に偏ったリガンド 57、β-アレスチンに偏ったリガンドなど、いくつかの偏ったリガンドには臨床的可能性があります。ドーパミン D2 受容体の作用58。 しかし、文献で報告されている偏ったリガンドの数はまだ限られています。 我々の結果は、β-AR/β-アレスチンに偏ったシグナル伝達がSRMの記憶にとって重要であることを示唆しており、記憶増強のための特異的なβ-アレスチンに偏った活性化を有する新規β-ARアゴニストの開発の可能性を実証している。

我々の研究は、LC-mPFC NE投影がβ-AR/β-アレスチンに偏ったシグナル伝達経路を介して社会的認識記憶の固定化を調節していることを示唆しており、記憶記憶におけるβ-アレスチンに偏った経路の神経生物学的機能の証拠を提供している。 これらのデータは、β-アレスチンに偏ったβ-アドレナリン作動性リガンドが、記憶の保存を改善し、精神疾患を治療するための潜在的な薬物標的である可能性があることを示しています。

Adrb1fl/fl および Adrb2fl/fl トランスジェニック雄マウスは私たちの研究室によって開発され、C57BL/6J 系統に 10 回以上戻し交配されました (Adrb1: ENSMUSE000000000294435; Adrb2: ENSMUSE00000399288)。 Arrb2fl/fl は、Pei Gang 教授 (中国科学院、上海生物科学研究所) のご厚意により提供されました。 TH-Cre マウスは Jackson Laboratory から購入しました (ストック番号: 008601)。 生後 5 週間の雄 C57BL/6J マウスを上海実験動物センター、CAS から購入しました。 すべてのマウスは、12 時間の明暗サイクル (20:00 ～ 8:00 点灯) で、水と餌を自由に摂取できる状態で、ケージあたり 3 ～ 4 匹のグループで飼育されました。 成体マウス (8 ～ 10 週齢) および老齢マウス (18 か月以上) を使用しました。 すべての行動テストはライトオフ期間中に実施されました。 すべての動物の治療は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに厳密に従っており、復丹大学上海医科大学の動物管理使用委員会によって承認されました。 子孫は以下のプライマーセットを使用して遺伝子型決定されました: 5'-CTGTTCGCATCGGAATGAAGC-3'。 5'-TGACGTCATGAACTGGGATTTCAG-3' (Adrb1fl/fl マウス); 5'-TTGCCGCAGTCTGAAGAAGC-3'; 5'-AGGAAGGATTGTCTCCCAGTATGAC-3' (Arrb2fl/fl マウス); 5'-GGTTGCACAGCAGCCCTAGAT-3'; 5'-CCGTTATGTGCACCAGACTTTAGG-3' (Adrb2fl/fl マウス); 5'-ガガカガアクトCGGGACCAC-3'; 5'-AGGCAAATTTTGGTGTACGG-3' (TH-Cre マウス)。 すべての行動被験者は、少なくとも 3 日間、実験者に個別に慣れさせられました。

プロプラノロール [(+/-)-プロプラノロール HCl] (Sigma-Aldrich、#P0884-1G) を生理食塩水に溶解しました。 カルベジロール (Tocris Bioscience、#2685) を 1% ジメチルスルホキシドを含む生理食塩水に溶解しました。 プロプラノロール (10 μg) またはカルベジロール (5 μg) を mPFC に両側から注入しました。 クロザピン N-オキシド [CNO] (Sigma-Aldrich、#C0832-5MG) を生理食塩水に溶解しました。 マウスにCNO(1mg/kg、腹腔内)を腹腔内注射した。

rM3Darr を搭載した pcDNA3.1 ベクターは、R​​165L 点変異を持つ M3 を含むこの構築物を生成した中島健一郎教授によって提供されました。 AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry は、前述のように、CNO 治療に応答して G タンパク質媒介経路を混乱させることなく、β-アレスチンに偏ったシグナル伝達を選択的に活性化するために開発されました 36。 pCAG-Cre-GFP (Addgene Plasmid # 13776) からの Cre 配列を、ECOR I および Sal I 制限酵素部位を介して pAAV2-THP-EGFP (Addgene Plasmid # 80336) にクローニングしました。 AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre、AAV9-mCaMKIIα-EGFP、AAV9-EF1α-Flex-ChrimsonR-tdTomato、AAV9-THP-Cre、scAAV1-hSyn-FlpO、および AAV9-EF1α-fDIO-Cre-mCherry がパッケージ化されましたTaitool Biological Co., Ltd.製 AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP、AAV9-EF1α-DIO-EYFP、AAV9-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry、AAV9-hSyn-DIO-mCherry、AAV9-hSyn- NE2h-EGFP、および AAV9-CAG-Cre は Neuron Biotech Co., Ltd. からパッケージ化されました。AAV9-EF1α-DIO-hChR2(H134R)-mCherry および AAV9-EF1α-DIO-mCherry は BrainVTA Co., Ltd. からパッケージ化されました。すべての実験では、2.0 × 1012 ～ 2.5 × 1012 ベクターゲノム (vg) ml-1 の範囲の AAV 力価を使用しました。 高力価の scAAV1-hSyn-FlpO (1 × 1013 ベクター ゲノム (vg) ml-1) を順行性感染に適用しました。

マウスをイソフルランで麻酔し（導入3.5％、維持1.5〜2％）、定位固定装置（Stoelting Instruments、米国）に設置した。 ウイルスを mPFC (ブレグマから: 前方-後方 (AP)、+ 1.8 mm; 内側外側 (ML)、± 0.30 mm、および背側-腹側 (DV)、-2.5 mm)、または LC (AP、 −5.4 mm、ML、±0.85 mm、DV、−4.0 mm）。 ウイルスは、ＵＭＰ３ウルトラマイクロポンプ（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）の制御下で、１０μｌシリンジおよび３６ゲージの鈍針を使用して、制御された体積および流速（５０ｎｌ／分で１５０ｎｌ）で送達された。 注射後、針をさらに 10 分間放置し、その後ゆっくりと取り外しました。 光ファイバー（NA 0.37、コア直径 200 μm、Anilab）を mPFC（AP、+1.9 mm、ML、±1.1 mm、および DV、-2.4 mm、角度 20°）の上に埋め込みました。 手術後、マウスを少なくとも 3 週間回復させてから、行動実験を行った。

マウスをイソフルランで麻酔し（導入３．５％、維持１．５〜２％）、定位固定装置に入れた。 薬物台座ガイドカニューレ（２７ゲージ、ＲＷＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を、ｍＰＦＣの１ｍｍ上に両側に移植した（ＡＰ、＋１．９ｍｍ；ＭＬ、±１．１ｍｍ；およびＤＶ、−１．４ｍｍ、２０°角度）。 行動試験の前に、動物を少なくとも 2 週間手術から回復させた。 1.0mmの突起を備えた34ゲージの鋼針を注入ポンプ(BAS Bioanalytical Systems Inc.)に接続した。 3 腔社交性テストまたは恐怖条件付けの後、プロプラノロール (10 μg)、カルベジロール (5 μg)、または生理食塩水をガイド カニューレを介して両側に注入しました。

動物に、0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液 (PB) 中の 4% パラホルムアルデヒド (PFA) を経心的に灌流し、さらに 4 時間後固定しました。 脳を３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクロース／リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で少なくとも４８時間凍結保護し、ビブラトーム（ＣＭ３０５０Ｓ、Ｌｅｉｃａ）によって切片を３０μｍで切片にした。 スライスを、0.3% Triton X-100 (PBST) を含む PBS 中の 10% 正常ヤギ血清でブロックし、TH59 (マウス、1:1000; Millipore AB152)、RFP60 (ウサギ、1:500; Rockland、 600-401-379) または GFP61 (ニワトリ、1:500; Thermo Fisher Scientific、A-10262)、PBST 中で 4 °C で一晩。 切片を室温 (RT) で各 15 分間、PBS で 3 回洗浄した後、二次抗体 [Alexa-488 または Cy3 IgG (マウス、ウサギ、またはニワトリ、1:50,000、Jackson ImmunoResearch)] を PBST 中でインキュベートしました。 2時間室温に保ちます。 次いで、切片をＰＢＳで３回、それぞれ１５分間洗浄し、その後、スライドに載せた。 画像は、10 倍または 20 倍の対物レンズを使用した Nikon A1 共焦点で表示および撮影されました。

社会的行動課題は、長方形の不透明なプレキシガラス製ボックス (長さ 40 cm × 幅 63 cm × 高さ 23 cm) の 3 チャンバー装置で実行されました。 箱は、小さな円形のドア (直径 7 cm) を備えた 2 つのプレキシガラス壁によって分割されていました。 2 つの外側チャンバー (長さ 40 cm × 幅 21 cm × 高さ 23 cm) が中央チャンバー (長さ 40 cm × 幅 21 cm × 高さ 23 cm) によって接続されました。 SRM テストは、慣れセッションと社交性テスト 10 の後に実施されました。

被験者のマウスを中央のコンパートメントに放し、各外側チャンバーに空のワイヤー容器を備えた 3 チャンバーのボックスを 3 日間連続して 10 分間探索させました。

4日目に、対象マウスと事前に接触したことのない若い雄マウス（新規マウス、生後3～5週目）を、「社会」区画として指定された1つの部屋の有線ケージに導入した。 一方、空のままの同一のワイヤーケージをもう一方のチャンバーに置きました。 被験者のマウスを中央の部屋に放し、試行間に 15 分の間隔を置いて 2 回の 10 分間の試行で 3 つの部屋を探索させました。 マウスが各ワイヤーケージの近位半径２ｃｍ以内を探索した時間（近づく、立つ、匂いを嗅ぐ取り付け、および鼻と鼻の接触時間）をカウントした。

SRM テストは社交性テストの 1 時間後、1 日後、または 4 日後に実施され、被験者のマウスは中央の部屋に 10 分間放たれました。 記憶保持試験中、一方のチャンバーにはワイヤーケージの中に見知らぬオスの幼体（新規マウス、生後3～5週目）が入っており、もう一方のチャンバーにはワイヤーケージの中に社交性テストで以前に曝露された見慣れたマウス（慣れ親しんだマウス）が入っていました。 したがって、慣れ親しんだマウスは社交性テストで使用されるものと同じであり、新しいマウスは各 SRM テストで異なります。 ここでも、新しいマウスと使い慣れたマウスの位置はセッション間でバランスがとれました。 ワイヤーケージは試験前および試験の間に徹底的に洗浄されました。 すべてのセッションはデジタル ビデオ カメラで録画されました。 各セッション中にマウスが馴染みのあるマウスと新しいマウスを探索した時間を、Ethovision XT ソフトウェア (Noldus、オランダ、ワーゲニンゲン) で分析しました。

社交性識別スコア (式 1) は次のように計算されました。

社会的記憶識別スコア (式 2) は次のように計算されました。

社交性テストの直後（ウイルス注入および光ファイバー移植の 3 ～ 4 週間後）に光遺伝学的刺激を与えました。 光ファイバーは、一対の FC/PC コネクターと光ファイバー 1 × 2 を備えたパッチ コードを介して 473 nm (青色光) または 590 nm レーザー (黄色光) (Shanghai Dream Lasers Technology Co. Ltd.) に接続されました。ロータリージョイント。 ChR2 を刺激するために、青色光を 5 mW、25 Hz、5 ms パルス 20 回、5 秒ごとに 5 分間照射しました。 eNpHR3.0 を刺激するために、黄色光を 10 mW で 10 分間継続的に照射しました。 光ファイバーを通るレーザー光出力は、デジタルパワーメーターコンソールによって調整され、Master 8 パルス刺激装置 (AMPI) によって変調されました。

AAV9-EF1α-Flex-ChrimsonR-tdTomato または AAV9-EF1α-DIO-eNpHR3.0-EYFP および AAV9-hSyn-NE2h-EGFP ウイルスを LC および mPFC に個別に注入しました。 光ファイバー (直径 200 μm、開口数 (NA) 0.48、Hangzhou Newdoon Technology) を mPFC に片側的に埋め込みました。 ウイルス注入および光ファイバー移植後 3 ～ 4 週間後に測光記録を実施しました。 光遺伝学的光刺激のために、光ファイバーをパッチコードを介して590nmレーザー(黄色光)(Thinker Tech Nanjing Biotech)に接続した。 mPFC の ChrimsonR+ NE 末端を刺激するために、光刺激 (590 nm、5 mW、5 ms パルス、5、25、および 50 Hz、持続時間 1 秒) を 15 秒ごとに 15 ～ 20 回の試行で 1 本の光ファイバーを通じて送達しました。 mPFCに埋め込まれています。 mPFC の eNpHR3.0 末端を刺激するには、mPFC に埋め込まれた 1 本の光ファイバーを通じて、15 秒ごとに 15 ～ 20 回の試行で光刺激 (590 nm、10 mW、10 秒継続) を与えました。 同時に、NE センサー NE2h62 の蛍光ダイナミクスが、mPFC に埋め込まれた同じ光ファイバーを通じて記録されました。 ファイバー測光は以前と同様に実行されました。 簡単に説明すると、NE センサーは、470 nm の波長と 405 nm の波長の LED 光に対応する 2 つの励起源を使用して励起されました。 光は励起フィルターを通過し、慢性的に埋め込まれたファイバーに接続された光ファイバーパッチケーブルに到達しました。 パッチケーブル先端の光強度は約0.25mWでした。 NE センサーの放射光は、同じファイバーを通って受光器に戻ります。 アナログ電圧信号は 100 Hz でデジタル化され、ソフトウェアファイバー測光 (Thinker Tech Nanjing Biotech) を使用して記録されました。 データは、個々の試験内の光刺激イベントに基づいてセグメント化されました。 刺激前の 2 秒間の Z スコアをベースラインとして採用しました。 測光データは、カスタム作成された MATLAB コード (MATLAB R2019a、MathWorks) を使用して分析されました。

恐怖条件付け課題のために、マウスを条件付けチャンバー(Med Associates)に3分間導入した。 1 日後、マウスをチャンバーに戻し、2 分間の試行間隔で 3 ペアのトーンフットショック (トーン: 2800 Hz、85 dB、30 秒、FS: 0.5 mA、1 秒) を与えました。 24 時間後、状況に応じた恐怖記憶テストを実施し、マウスを緊張を与えずに条件付けチャンバーに 3 分間曝露しました。 マウスの別のコホートは、新しい状況で、30秒間隔で音（2800 Hz、85 dB、30秒）を3回試行する合図恐怖記憶テストを実施しました。 凍結に費やした時間の割合は、コンピューター プログラム (Med Associates) によって自動的に分析されました。

OF テストは、げっ歯類の運動活動と生来の不安レベルを評価するために最も頻繁に使用される方法の 1 つです。 試験の 2 日前に、マウスを OF 試験が行われる環境に慣れさせました。 運動活動は、オープンフィールドアリーナ（40×40cm）で25ルクスの輝度下で30分間測定されました。 装置は試験前と試験の間に洗浄されました。 中央エリアの合計距離、距離、継続時間は、自動検出システム (TopScan、CleverSys. Inc.) を使用して分析されました。

L/D ボックス (46 × 27 × 30 cm) はプレキシガラス製で、2 つのコンパートメントで構成されていました。 大きいセクションは明るいコンパートメント (箱の 3 分の 2) であり、小さいセクションは暗いコンパートメント (箱の 3 分の 1) でした。 テストはライトボックス内で 25 ルクスの輝度で実施されました。 マウスをライトボックスの中心から入り口に背を向けて放し、装置内を6分間探索させた。 L/D ボックスは試行前と試行の間に洗浄されました。 暗室で過ごした時間を自動検出システム (TopScan、CleverSys. Inc.) を使用して分析しました。

高架 O 迷路は、側面に壁を備えた 2 つの開いたアームと 2 つの閉じたアームで構成されていました。 O迷路の高さは床から100cmでした。 マウスをオープンアームの中央に置き、6分間探索させました。 O 迷路は各トレイルの前とトレイルの間で清掃されました。 各アームで費やした時間を、Clever System ソフトウェア (TopScan、CleverSys. Inc.) で分析しました。

マウスを最初に生理食塩水で心臓内に灌流し、次に0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4 緩衝液(pH = 7.5)中の4%パラホルムアルデヒドで灌流し、脳を取り出した。 4% パラホルムアルデヒドで 4 時間後固定した後、サンプルを 30% スクロース/PBS で 3 日間保存しました。 FISH は、RNAscope 手順 (Advanced Cell Diagnostics, Inc.、米国カリフォルニア州ニューアーク) に従って、厚さ 10 μm の固定凍結脳スライスに対して実行されました。 簡単に言うと、凍結切片 (厚さ 10 μm) を mPFC 層を通して冠状に切断しました。 切片をSuperfrost Plus Microscope Slides（Fisher Scientific、Waltham、USA）上に解凍マウントし、室温で10分間プロテアーゼ消化のために前処理しました。 次に、切片をマウス Adrb1 および Adrb2 のプローブ (Adrb1、アクセッション番号: NM_007419.2、ターゲット領域 158 ～ 1830; Adrb2、アクセッション番号: NM_007420.3、ターゲット領域 55 ～ 962) とともに 40 °C で 2 時間インキュベートしました。スライドごとに標識されたプローブ混合物。 非特異的にハイブリダイズしたプローブは、切片を 1 × 洗浄バッファーで室温で洗浄し、続いて Amplifier 1-FL で 30 分間、Amplifier 2-FL で 30 分間、Amplifier 3-FL で 40 °C で 15 分間洗浄することによって除去しました。 各増幅器は、室温で２分間、１×洗浄緩衝液で洗浄することによって除去された。 スライドは、LSM 510 顕微鏡 (Zeiss) で観察、分析、および写真撮影されました。

AAV9-mCaMKIIα-EGFP-P2A-iCre ウイルスを、Arrb2fl/fl マウスおよびその WT 同腹子の mPFC に注射しました。 ４週間後、ｍＰＦＣを氷上でマウス用Ｍａｘｔｒｉｘ（Ｐｌａｓｔｉｃ ｏｎｅ Ｉｎｃ．）を用いて直ちに解剖した。 TRIzol®試薬（Thermo Fisher Scientific Inc、Waltham、MA、USA）を使用して、Arrb2fl/fl マウスおよび WT マウスの mPFC から全 RNA を抽出しました。 ランダムプライマーによる逆転写は、Hiscript QRT SuperMix システム (Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd) に従って、42 °C で 2 分間、50 °C で 15 分間、85 °C で 2 分間からなる 1 サイクル プログラムで実行されました。 。 定量的 PCR は、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Nanjing Vazyme Biotech Co., Ltd) を使用し、リアルタイム PCR サーモサイクラー (Eppendorf realplex2 Mastercycler ep realplex、ドイツ) により 3 回実行しました。 CKO Arrb2 mRNA のプライマーは、エクソン 2 に隣接するように設計されました (5'-GGGAGGGGAAGGAGGAGAAAA-3' および 5'-TGCAGTTAGGGCTCGACTTC-3')。 WT Arrb2 mRNA のプライマーは、エクソン 2 (5'-GGGAGGGGAAGGAGGAGAAAA-3' および 5'-TGCAGTTAGGGCTCGACTTC-3') 内に設計されました。 GAPDH のプライマーは、5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' および 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' です。

マウス神経芽腫 (N2a) 細胞は、Pei Gang 教授 (中国科学院、上海生物科学研究所) のご厚意により提供されました。 N2a 細胞を 12 ウェル プレートにウェルあたり 20,000 細胞でプレーティングしました。 20時間後、リポフェクタミン2000トランスフェクション試薬（Invitrogen、Thermo Fisher Scientific）を使用して、細胞にAAV-hSyn-DIO-rM3Darr-mCherry/CAG-creおよびβ-アレスチン2-shRNAを一時的にトランスフェクトしました。 約４８時間後、細胞を無血清培地中で一晩インキュベートした後、ＣＮＯ（１μＭ）刺激した。 次いで、細胞を氷上のRipa溶解緩衝液(Beyotime、#P0013B)によって回収した。

実験マウスは、幼若マウスと 3 日間共同飼育されました。 社交性テスト中、マウスは、馴染みのあるマウスまたは新しいマウスが入った金網ケージを含む 3 つの部屋に曝露されました。 社交性テストの対照として、マウスを光刺激ありまたはなしでホームケージに滞在させた。 マウスは、光刺激の有無にかかわらず社交性テストの15分後に屠殺された。 標準的な 3 腔 SRM タスクを別のマウスのコホートで実施し、社交性テストとその後のレーザー刺激の 15 分後に屠殺しました。 脳を直ちに取り出し、mPFC からの組織サンプルまたは細胞タンパク質サンプルを 1.0 μM フェニルメチルスルホニルフルオリド (Beyotime、#P0013B) を含む溶解バッファーでホモジナイズし、氷上で 30 分間インキュベートし、12,000 × g で 15 分間遠心分離しました。 4℃。 タンパク質濃度は、BCA アッセイ (Thermo Fisher Scientific、#23227) によって測定しました。 各サンプルを最終タンパク質濃度 2 μg/μl に調整し、6 × SDS ローディングバッファー (Beyotime、#P0015F) と混合し、95 °C で 10 分間煮沸しました。 サンプルを 10% ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) にロードしました。 タンパク質を電気泳動によってゲルからニトロセルロース (NC) 膜 (Whatman) に移し、次に次の一次抗体とともにインキュベートしました: 抗 pERK63 (1:1000 希釈、#9101 S、Cell Signaling Technology)、抗 ERK63 (1:2000 希釈) 、#4696 S、Cell Signaling Technology) 4 °C で一晩。 メンブレンを、0.1% Tween-20 (TBST) を含む Tris 緩衝生理食塩水で 15 分間 3 回リンスし、次に IRDye 700DX または 800DX 結合抗ウサギまたは抗マウス免疫グロブリン G (IgG) (1:50,000; Rockland Immunochemicals Inc.) を室温で 1.5 時間静置します。 タンパク質バンドは、Odyssey (LI-COR Biosciences) を使用して視覚化しました。 イムノブロットはImage Jソフトウェアで分析されました。 ERK リン酸化レベルは、pERK の強度を総 ERK 発現に対して正規化することによって計算されました。

実験データは平均±標準誤差として表され、GraphPad Prism でプロットされました。 行動試験からのデータは、両側スチューデント t 検定、一元配置分散分析 (ANOVA)、または反復測定を伴う二元配置 ANOVA と、それに続く被験者内因子としてのセッションと AAV としてのボンフェローニの事後検定によって分析されました。被験者間の要因。 測光記録は、蛍光トランジェントについての両側スチューデント t 検定または一元配置分散分析を使用して分析されました。 免疫蛍光データは両側スチューデント t 検定によって分析されました。 ウェスタンブロットデータは二元配置分散分析によって分析されました。 非正規化データは、ランクに関するマン・ホイットニー U 検定およびクラスカル・ウォリス一元配置分散分析を使用して分析されました。 各データセットに対応する完全な統計分析は補足データ 1 に示されています。図に報告されているように、すべての実験は 4 ～ 15 匹のマウスで独立して再現されました。 可能な場合、データは生物学的複製 (in situ ハイブリダイゼーション実験のために分析される動物あたり複数の脳のスライス) を使用して収集されました。 私たちのサンプルサイズはこれまでの経験に基づいて推定されており、現場で一般的に使用されているものと同様です。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

論文の結論を評価するために必要なすべてのデータは、論文および/または補足資料に記載されています。 補足図 10 には、論文内のすべてのブロットのトリミングされていないバージョンが含まれています。 補足データ 2 には、図の基礎となるソース データ値が含まれています。 1d、f、j、l、n、o、2c、f、i–j、3c–d、f–h、4c–f、h、5a、b、e–f、h、j、および 6b、d 。

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Kelly, A.、Laroche, S. & Davis, S. 海馬回路におけるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ/細胞外シグナル調節キナーゼの活性化は、認識記憶の固定と再固定に必要です。 J. Neurosci. 23、5354–5360 (2003)。

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Arrb2fl/fl マウスについては Gang Pei 博士 (中国科学院、上海生物科学研究所) に、R165L 変異体 M3 構築については中島健一郎博士に感謝します。 この研究は、中国科学技術イノベーション2030プロジェクト（FWおよびLMへの2021ZD0203500、XLへの2021ZD0202104）、中国国家自然科学財団補助金（XLへの32171041、LMへの31930046、LMへの82021002）、CAMSイノベーション基金によって支援されました。医学科学研究（2021-I2M-5-009からLMおよびXL）、上海市科学技術メジャープロジェクト（2018SHZDZX01からLM）、ZJ Labおよび上海脳科学および脳インスピレーション技術センター、および中国博士研究員科学財団(DC への 2021M690684)。

基礎医科学部、医療神経生物学国家重点研究所、MOEフロンティア脳科学センター、脳科学研究所、神経科、復旦大学華山病院薬理学研究センター、200032、上海、中国

Deqin Cheng、Junwen Wu、Enhui Yan、Xiaocen Fan、Feifei Wang、Lan Ma、Xing Liu

中国医学科学院中毒記憶研究ユニット (2021RU009)、200032、上海、中国

Deqin Cheng、Junwen Wu、Enhui Yan、Xiaocen Fan、Feifei Wang、Lan Ma、Xing Liu

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DC、XL、LM が実験を計画しました。 DCとJWは行動検査を実施した。 DCとEYは定位固定手術と生化学実験を実施した。 DC は細胞培養とウェスタンブロッティング実験に貢献しました。 XF は FISH アッセイを実施しました。 DC、EY、JW、FW がデータを分析しました。 DCとXLが原稿を起草した。 XL と LM は原稿を修正しました。

Lan Ma または Xing Liu への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Felix Leroy、Steven (A) Thomas、およびその他の匿名の査読者に感謝します。 主な担当編集者:クリスチャン・ウォズニーとジョージ・イングリス。 査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Cheng, D.、Wu, J.、Yan, E. 他社会的認識記憶のノルアドレナリン作動性固定化は、マウス前頭前野におけるβ-アレスチンに偏ったシグナル伝達によって媒介される。 Commun Biol 5、1097 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04051-y

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受信日: 2022 年 3 月 14 日

受理日: 2022 年 9 月 28 日

公開日: 2022 年 10 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04051-y

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